Ccar1通过阻止β-catenin核转位维持R2i条件下小鼠胚胎干细胞的原始多能性

本研究针对R2i（MEK/TGFβ双重抑制）培养条件下小鼠胚胎干细胞（mESCs）多能性维持机制，发现细胞周期与凋亡调节因子1（Ccar1）通过抑制β-catenin核转位调控Wnt信号通路，从而维持干细胞自我更新。研究采用siRNA敲降结合免疫荧光、qRT-PCR等技术，证实Ccar1缺失导致β-catenin入核激活分化相关基因（Cdx1/Wnt3a等），同时降低多能性标记物（Nanog/Rex1）表达，为干细胞命运调控提供了新靶点。

　　

在生命科学领域，胚胎干细胞（ESCs）的自我更新和多能性维持机制一直是研究热点。科学家们发现，通过特定抑制剂组合可以调控干细胞状态——比如经典的2i（MEK/GSK3抑制剂）和本文研究的R2i（MEK/TGFβ抑制剂）体系。但有趣的是，虽然这些培养条件都能维持干细胞特性，其内在分子机制却存在显著差异。这就像用不同配方培育同一种花卉，虽然都能开花，但生长过程却各有奥秘。

问题的关键在于β-catenin这个"多面手"蛋白。它既是细胞粘附复合体的重要成员，又是Wnt信号通路的核心效应分子。当β-catenin进入细胞核，它会激活一系列促进分化的基因；而停留在胞质时，反而有助于维持干细胞特性。这种"位置决定命运"的现象引发了研究者思考：在R2i培养条件下，是否存在某种分子"守门员"专门阻止β-catenin入核？

来自伊朗Royan研究所的Sara Taleahmad团队对此展开了深入研究。他们此前通过蛋白质组学分析发现，R2i条件下细胞周期与凋亡调节因子1（Ccar1）的表达量异常升高——比常规血清培养高5.6倍，比2i培养高2.6倍。这个线索促使他们提出大胆假设：Ccar1可能就是那个调控β-catenin定位的关键分子。

为验证这一假说，研究人员采用siRNA特异性敲降Ccar1，通过免疫荧光观察到β-catenin明显向核内聚集。就像撤掉了细胞核的"门卫"，原本被挡在门外的β-catenin长驱直入。随之而来的是一系列连锁反应：qRT-PCR检测显示Wnt靶基因（Cdx1、Wnt3a等）表达显著上调，而多能性标志物（Nanog、Rex1）则明显下调。这些变化生动诠释了"位置决定功能"的生物学原理——β-catenin在核内启动分化程序，同时削弱干细胞自我更新能力。

研究还发现Ccar1影响细胞周期调控网络。敲降Ccar1后，关键细胞周期基因（c-myc、Tbx3）表达下降，这与Ccar1已知的细胞增殖调控功能相符。这些结果共同描绘出一个立体调控网络：Ccar1如同细胞内的"交通指挥"，既通过约束β-catenin的"活动范围"来维持干细胞特性，又参与调控细胞增殖进程。

技术方法上，研究采用Royan B20小鼠胚胎干细胞系，设置2i、R2i和血清三种培养条件对照。通过siRNA转染实现Ccar1特异性敲降，运用免疫荧光技术观察蛋白亚细胞定位，qRT-PCR定量检测基因表达变化，Western blot验证蛋白水平改变。统计分析采用单因素方差分析（ANOVA）与Tukey事后检验。

研究结果部分：

3.1 R2i条件下细胞周期与凋亡调节蛋白1的上调

通过比较三种培养条件，证实Ccar1在R2i条件下表达量最高，且细胞保持正常核型、碱性磷酸酶活性和多能性标志物（Oct-4、Nanog）表达。

3.2 Ccar1可与β-catenin在R2i条件下相互作用

序列比对显示小鼠与人类Ccar1/β-catenin高度保守。siRNA敲降Ccar1后，免疫荧光证实β-catenin发生核转位，暗示两者存在功能关联。

3.3 抑制Ccar1降低细胞周期靶基因表达

敲降Ccar1导致细胞周期调控基因（c-myc、Tbx3）表达下调，提示其在增殖调控中的重要作用。

3.4 β-catenin核转位与Wnt靶基因表达相关

β-catenin入核后激活典型Wnt靶基因（Cdx1、Wnt3a等），证实其转录激活功能。

3.5 胞质β-catenin介导R2i培养细胞的自我更新

Ccar1缺失导致多能性基因（Nanog、Rex1）表达降低，但Oct4无显著变化，表明其通过特定通路影响干细胞状态。

讨论与结论：

这项研究揭示了R2i培养条件下维持mESCs多能性的新机制——Ccar1通过阻止β-catenin核转位，抑制分化信号并维持自我更新。与癌症研究中发现的CCAR1促进β-catenin转录活性的作用不同，在干细胞中Ccar1主要发挥"禁锢"功能，这种情境依赖性功能为理解蛋白质的多元调控提供了范例。

研究也存在局限，如未直接证明Ccar1-β-catenin物理相互作用，这将是未来研究方向。从应用角度看，调控Ccar1表达可能成为优化干细胞培养体系的新策略，也为再生医学中细胞命运操控提供了潜在靶点。论文发表在《Biochemistry and Biophysics Reports》，为干细胞生物学与信号转导领域的交叉研究增添了重要拼图。