DETOX纳米系统：一种递送BoNT/A LC结构域至缺血神经元的新型树突状纳米载体

缺血性中风是全球致死致残的主要原因，现有疗法因缺乏神经保护作用而效果有限。本研究开发了一种名为DETOX的创新型树突状纳米系统，通过可生物降解的PEG-树突状嵌段共聚物（fbB）递送肉毒杆菌神经毒素A型（BoNT/A）轻链（LC）结构域。该系统能高效负载LC（效率达84%），显著增强SNAP-25剪切效率（较BoNT/A提升38%），并在缺血模型中减少谷氨酸外排。DETOX纳米颗粒成功穿透3D血脑屏障模型，为中枢神经系统疾病治疗提供了突破性策略。

　　

缺血性中风是全球第三大死亡原因，现有疗法如组织纤溶酶原激活剂（tPA）和机械取栓仅能恢复血流，却无法解决由谷氨酸过度释放引发的兴奋毒性这一核心病理机制。传统N-甲基-D-天门冬氨酸受体（NMDAR）拮抗剂因严重副作用在临床试验中屡屡失败。面对这一困境，葡萄牙i3S研究所的Marília Torrado团队独辟蹊径，将目光投向了肉毒杆菌神经毒素A型（BoNT/A）——这种能特异性切割突触小体相关蛋白25kDa（SNAP-25）的"分子剪刀"，但其临床应用却受限于全身毒性和侵入性给药方式。

研究人员创新性地提出"去毒素化"策略：仅使用BoNT/A的50kDa轻链（LC）催化结构域，通过专利的可生物降解PEG-树突状嵌段共聚物（fbB）进行递送，构建出命名为DETOX的纳米系统。这项突破性研究发表在《Biomaterials》期刊，首次报道了在PEG末端设计可标记氨基的树突状聚合物，并通过荧光标记Cy5.5实现了纳米颗粒的生物追踪。

关键技术包括：1）利用大肠杆菌表达系统生产高纯度（98.86%）重组BoNT/A LC蛋白；2）创新合成"可标记"三代PEG-GATGE树突状聚合物（G3）；3）通过动态光散射（DLS）和透射电镜（TEM）表征纳米颗粒理化性质；4）建立原代小鼠皮层神经元培养模型评估SNAP-25剪切效率；5）采用氧糖剥夺（OGD）模型模拟缺血条件；6）构建3D全人源血脑屏障（BBB）模型测试渗透性。

【3.1 重组BoNT/A LC的成功制备】

研究团队优化表达纯化流程，获得30.75 mg/L产量的可溶性LC蛋白。圆二色谱（CD）证实其二级结构与天然构象高度一致，zeta电位测定显示生理pH下带负电（-11mV），为后续纳米复合物构建奠定基础。

【3.3 新型"可标记"PEG-树突状嵌段共聚物的开发】

通过创新的BOC保护策略，首次在PEG末端引入氨基反应位点，成功连接Cy5.5荧光标记。核磁共振氢谱（¹H NMR）证实三代树突状聚合物（G3）结构正确，表面27个苄胺基团为蛋白负载提供正电荷锚点。

【3.4 fbB树突状聚合物高效复合LC蛋白形成DETOX纳米颗粒】

DETOX展现出理想的中枢递送特性：粒径<53 nm（DLS测定）、球形形貌（TEM观察）、温和正电荷（+1.4mV）。独创的槽印迹法揭示其LC负载效率高达84%，远超文献报道的PAMAM-G4树突状载体（45-55%）。

【3.5 DETOX纳米颗粒高效剪切SNAP-25且无细胞毒性】

在50 nM LC浓度下，DETOX 50:1处理48小时可实现38%的SNAP-25剪切率，显著优于BoNT/A全毒素（29%）。活死染色和代谢活性实验证实，即使最高剂量也未见神经元毒性，β3-tubulin染色显示神经突触网络保持完整。

【3.6 DETOX展现更快速的催化作用】

动力学研究显示DETOX 50:1在3小时即显现活性，而BoNT/A需12小时。内吞抑制实验揭示其通过小窝蛋白介导的内吞途径入胞，但独特地规避了经典的内体/溶酶体酸化过程，这可能是其快速起效的关键。

【3.7 DETOX纳米颗粒在缺血条件下减少谷氨酸外排】

OGD模型证实，DETOX 50:1处理使细胞外谷氨酸降低40%。这一效果与SNAP-25剪切程度正相关，为兴奋毒性调控提供了直接证据。

【3.8 DETOX显著穿透人源血脑屏障】

在3D BBB模型中，DETOX表现出优异渗透性：有效渗透系数（P_e）达1.90×10^-6 cm/s，24小时脑侧累积量达44%。共聚焦成像显示其成功穿越内皮细胞层且不被截留，为系统给药提供可能。

这项研究通过多学科交叉创新，首次实现了BoNT/A催化结构域的安全高效递送。其科学价值体现在：1）创建新型"可标记"树突状载体平台技术；2）阐明非经典内吞的细胞摄取机制；3）验证缺血条件下谷氨酸调控效果。临床转化意义在于：为中风治疗提供兼具神经保护与微创给药特性的解决方案，同时为其他中枢神经系统疾病（如癫痫、帕金森病）的BoNT治疗开辟新途径。未来通过神经元靶向修饰，有望进一步提升其治疗精准度。