高通量筛选发现靶向OXCT1双酶活性的肝癌治疗抑制剂

肝癌治疗面临OXCT1双酶活性靶向抑制的难题。研究人员通过结构分析发现OXCT1的酮解（ketolytic）和琥珀酰转移酶（succinyltransferase）活性位点位于同一口袋，开发了基于OD313和荧光偏振（FP）的高通量筛选系统，结合虚拟筛选鉴定出新型抑制剂iOXCT1。该化合物可同时抑制OXCT1双功能，在体外和体内实验中显著抑制肝癌生长，为代谢靶向治疗提供新策略。

　　

代谢重编程（metabolic reprogramming）是肝癌细胞的典型特征，其中线粒体酶3-氧酸CoA转移酶1（OXCT1）通过酮体代谢（ketolysis）和蛋白琥珀酰化（succinylation）双重功能促进肿瘤进展。尽管OXCT1是潜在治疗靶点，但现有抑制剂如匹莫齐特（Pimozide）存在血脑屏障穿透性和多靶点副作用等问题，且尚无能同时阻断其双酶活性的特异性小分子。这一领域亟需开发兼具选择性和高效性的新型抑制剂。

为解决这一难题，中国科学技术大学Huafeng Zhang团队在《Bioorganic Chemistry》发表研究，通过结构分析发现OXCT1的酮解活性位点E344和琥珀酰转移酶活性位点G424位于同一口袋。研究人员创新性地建立了两种高通量筛选系统：基于Mg²⁺触发的实时OD₃₁₃检测酮解活性平台，以及采用荧光标记肽段和特异性抗体的FP法琥珀酰转移酶检测系统。结合虚拟筛选53,200种化合物，最终鉴定出先导化合物D574–0246（iOXCT1）。

关键技术包括：1）使用HepG2细胞异种移植模型进行体内药效评估；2）细胞热转移实验（CETSA）验证靶点结合特异性；3）分子对接（DOCK6.9/AutoDock Vina）分析结合模式；4）基于ELISA的肝肾功能毒性检测。

2.1 高通量筛选系统的建立

通过分子对接发现OXCT1双活性位点共享结合口袋（图1A）。优化后的酮解检测系统采用MgCl₂触发反应，5分钟内可完成96孔板筛选（图1C）。FP法琥珀酰转移酶检测则通过抗体识别琥珀酰化肽段，40分钟完成高通量筛选（图1F）。两种系统均通过匹莫齐特验证了可靠性（图1E,I）。

2.2 双活性抑制剂的发现

虚拟筛选以Vina评分<-13为阈值，从53,200种化合物中初筛1,023种（图2B）。通过双重酶活检测和细胞毒性实验，最终获得7个候选分子（图2E），其中iOXCT1对HepG2细胞的IC₅₀为6.656 μM（表1）。

2.3 iOXCT1的作用机制

iOXCT1可剂量依赖性地降低LACTB蛋白K284位点琥珀酰化水平（图3A）。CETSA证实其特异性结合OXCT1而非OXCT2或ACAT（图3D）。分子模拟显示其通过L366/M423等残基的疏水作用占据催化口袋（图3F）。

2.4 体内药效验证

在裸鼠模型中，55 mg/kg iOXCT1每3天给药可抑制OXCT1过表达肿瘤的生长（图4B-D），且不影响肝肾功能（图4G）。Western blot显示该化合物能显著降低肿瘤组织琥珀酰化水平（图4E）。

这项研究首次证实同时靶向OXCT1双酶活性的治疗策略可行性。iOXCT1通过占据共享口袋抑制酮解和琥珀酰转移酶活性，其特异性优于现有药物，且体内毒性可控。该发现不仅为肝癌治疗提供新靶点，更为代谢酶多功能抑制剂的开发树立范例。未来研究需进一步优化化合物溶解性（当前最高5.5 mg/mL）并探索与其他疗法（如免疫治疗）的联合应用潜力。