加拿大安大略省辉瑞/BioNTech与Moderna modRNA COVID-19疫苗中残留质粒DNA及SV40启动子-增强子序列的定量研究

本研究通过Qubit荧光定量与qPCR技术，对加拿大分发的16批次32瓶COVID-19 modRNA疫苗进行检测，发现辉瑞与Moderna疫苗中残留DNA含量分别超标36-627倍，其中辉瑞疫苗独含SV40启动子-增强子序列（23.72 ng/剂），存在潜在基因组整合风险。研究强调脂质纳米颗粒（LNP）高效转染下现行监管标准（10 ng/剂）的局限性，呼吁基于累计给药与DNA功能特性修订安全指南。

　　

研究背景

COVID-19 modRNA疫苗的生产依赖质粒DNA模板的体外转录（IVT），而残留DNA的清除效率直接影响产品安全性。辉瑞与Moderna采用不同纯化工艺（PCR扩增 vs. 大肠杆菌直接提取），导致质粒载体成分差异。前期研究已发现疫苗中存在高水平质粒DNA，但缺乏系统性定量分析。

材料与方法

研究团队从加拿大安大略省药房获取32瓶疫苗（辉瑞6批次10瓶，Moderna 10批次22瓶），采用两种独立方法检测：

1. 1.

   Qubit荧光定量：检测总DNA含量，并通过RNase A处理消除modRNA干扰；

2. 2.

   qPCR靶向检测：针对刺突蛋白（spike）、质粒复制原点（ori）及SV40启动子-增强子-ori序列设计引物。

   另通过牛津纳米孔测序（ONT）分析DNA片段长度分布，并评估DNase I敏感性以验证LNP包裹DNA的稳定性。

关键发现

残留DNA含量

• •

  总DNA：辉瑞371–1,548 ng/剂，Moderna 1,130–6,280 ng/剂，均超FDA/WHO标准（10 ng/剂）36-627倍；

• •

  特异性序列：辉瑞疫苗中SV40启动子-增强子-ori含量最高达23.72 ng/剂（超限2倍），Moderna未检出该序列。

DNA特性分析

• •

  片段长度：ONT测序显示DNA片段平均214 bp，最长3.5 kb，含完整KanR抗性基因；

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  LNP保护效应：DNase I实验证实90%以上DNA被LNP包裹，逃避酶解。

监管与安全争议

现行指南未考虑LNP转染效率提升100倍及累计给药（如日本7剂接种）的风险。SV40序列可能通过结合p53蛋白诱发基因组不稳定，而短至7 bp的DNA片段仍具整合潜力。

临床关联性

VAERS数据显示，高DNA负载批次（如辉瑞FD0810）关联不良事件（AE）及严重不良事件（SAE）报告率显著上升（加拿大SAE占比58%）。Moderna BA.1二价疫苗因modRNA异质性导致ori清除效率异常，凸显工艺一致性缺陷。

结论与展望

研究揭示modRNA疫苗中残留DNA的复杂性与潜在风险，呼吁：

1. 1.

   修订监管标准，纳入LNP转染效率与DNA功能评估；

2. 2.

   强制多靶点qPCR检测（非单一KanR基因）；

3. 3.

   长期监测基因组整合事件。

   未来需在法医级条件下复现结果，并探索DNA片段与自身免疫病、肿瘤的潜在关联。