水牛与牛CD4+T淋巴细胞多功能性比较：牛结核病感染中抗原特异性细胞因子反应的种间差异研究

本研究通过多色流式细胞术建立高分辨率分析平台，首次系统比较水牛与牛在牛结核病（BTB）感染中CD4+T细胞产生的IFN-γ、TNF-α和IL-17A等细胞因子的单/共表达特征。研究发现IGRA阳性动物中IFN-γ+TNF-α+双阳性T细胞显著增加，揭示了种间免疫应答差异为优化诊断策略提供新依据。

　　

水牛与牛CD4⁺T淋巴细胞多功能性比较研究

1 引言

牛结核病（BTB）是由牛分枝杆菌（Mycobacterium bovis）引起的慢性传染病，对水牛和牛等反刍动物造成严重威胁。尽管牛对BTB的免疫应答已有较深入认知，但作为重要经济畜种的水牛其免疫机制仍不明确。研究团队通过建立多色流式细胞术平台，首次系统比较两种动物在抗原刺激下CD4⁺T细胞产生的IFN-γ、TNF-α和IL-17A等关键细胞因子的表达特征，为理解种间免疫差异提供新视角。

2 材料与方法

研究纳入35头水牛（17头IGRA阳性来自BTB暴发场，18头阴性）和10头牛（6头阳性，4头阴性）。通过6小时PPD-B体外刺激后，采用四色抗体 panel（CD4-PE-Cy7、TNF-α-FITC、IL-17A-PE、IFN-γ-AF647）进行胞内染色。创新性地应用混合数据因子分析（FAMD）解析细胞亚群分布模式，并通过荧光减一对照（FMO）确保设门准确性。

3 结果

3.1 流式细胞术验证

预实验证实抗牛细胞因子抗体与水牛抗原具有交叉反应性。PPD-B刺激后，IGRA阳性水牛中IFN-γ⁺（8.2% vs 1.5%）和IFN-γ⁺TNF-α⁺（4.3% vs 0.7%）CD4⁺T细胞频率显著高于阴性组，且与IGRA结果呈强正相关（r=0.85）。

3.2 种间差异特征

FAMD分析显示，Dim1（33%方差）由IFN-γ主导，Dim2（21.3%）则反映IL-17A相关变异。尽管总体应答相似，牛群中IL-17A⁺及其共表达亚群（如TNF-α⁺IL-17A⁺）频率更高，雷达图直观展示这种"细胞因子表达指纹"的种属特异性。

3.3 农场分组分析

将水牛细分为BTB场阳性组（A）、同场阴性组（B）和无结核场组（C）后，A组IFN-γ⁺IL-17A^neg亚群频率达12.5%，显著高于B/C组（<3%）。值得注意的是，C组TNF-α⁺基线水平略高，提示环境微生物可能塑造基础免疫状态。

4 讨论

本研究揭示水牛与牛在BTB感染中共享IFN-γ主导的免疫应答核心模式，但存在重要细微差异：

1）水牛IGRA阳性个体更易产生IFN-γ⁺TNF-α⁺双功能T细胞，这种"效应细胞标签"与人类活动性结核特征相似；

2）牛群中IL-17A相关亚群更丰富，可能反映其更活跃的Th17通路激活；

3）农场环境显著影响TNF-α基础水平，这对解释田间检测结果具有启示意义。

技术层面，研究建立的6小时全血刺激方案克服了传统24小时培养的细胞凋亡问题，而FAMD算法的应用则实现了高维数据的可视化解析。这些发现不仅为理解反刍动物结核免疫提供新框架，也为开发种属特异的诊断标志物和疫苗策略奠定基础。未来需扩大样本验证IL-17A的防护作用，并探索CD8⁺和γδ T细胞的贡献。