细菌谷氨酰胺合成酶作为新型代谢选择标记通过调控选择严格性提升CHO细胞培养性能

本研究创新性地将细菌来源的谷氨酰胺合成酶（GS-I）作为代谢选择标记应用于CHO细胞（Chinese Hamster Ovary），通过结构-功能分析揭示催化双漏斗几何特征决定酶活性，实现抗体滴度3-4倍提升。该策略突破传统哺乳动物GS（GS-II）系统的局限性，为生物制药细胞株开发提供全新工具。

　　

摘要

研究探索细菌谷氨酰胺合成酶（GS-I）作为新型代谢选择标记在CHO细胞中的应用。从肠杆菌和放线菌中筛选的ProvGS、PhotoGS和BudGS三种酶在GS缺陷型CHO细胞中表现出功能活性，相较中国仓鼠（Cricetulus griseus）内源GS-II使抗体滴度提升3-4倍。结构分析表明，酶功能性与溶剂可及性及催化结合口袋几何特征相关，非活性变体显示更封闭的双漏斗结构。转录组证实细菌GS在哺乳动物细胞中可解耦调控机制，通过调节选择严格性显著提升表达性能而不影响生物工艺行为。

1 引言

单克隆抗体市场需求持续增长，CHO细胞因其适合大规模悬浮培养、易基因修饰等优势成为主流生产系统。传统谷氨酰胺合成酶（GS）选择系统依赖内源GS-II和抑制剂MSX，但存在选择效率低等问题。细菌GS-I与真核GS-II虽在寡聚状态（dodecamer vs. decamer）上存在差异，但催化机制高度保守。本研究首次将细菌GS-I应用于哺乳动物细胞，通过结构优化和选择严格性调控实现性能突破。

2 结果

2.1 细菌GS在哺乳动物细胞中的鉴定

从Providencia vermicola等6种细菌中筛选GS-I酶，序列同源性仅18%（vs. C. griseus GS-II），但催化位点残基高度保守。系统发育分析显示所选酶代表不同生存环境（如Photohabdus luminescens为昆虫病原体）。

2.2 功能验证

ProvGS、PhotoGS和BudGS转染的CHO细胞在无谷氨酰胺培养基中成功增殖，12天时活力>90%。PhotoGS细胞生长最快（峰值密度2.7×10⁶ cells/mL），而ProvGS组谷氨酰胺合成速率最低（1.4 ng/cell/day）。抗体滴度达34.2 mg/L，显著高于内源GS对照组（11.3 mg/L）。Western blot证实非功能性ArsenoGS和BrennGS存在翻译后问题。

2.3 结构分析

分子动力学模拟显示功能性GS的ADP结合位点溶剂可及表面积（SASA）更高。关键残基ARG³²²、HIS²⁷²和PHE²²⁶的构象差异影响双漏斗可及性（图3C），这与酶活性直接相关。

2.4 生物工艺评估

小型生物反应器中，ProvGS细胞峰值密度达32.7×10⁶ cells/mL，抗体产量4.2 g/L（Qp=17.2 pg/cell/day）。转录组PCA分析显示细菌GS未引起显著基因表达差异，证实其与宿主调控网络解耦。

2.5 长期稳定性

表达IgG-ScFv融合蛋白的ProvGS克隆株在60代培养后仍保持高产（5.9 g/L）和基因组稳定性（Southern blot显示整合位点未重排）。

3 讨论

细菌GS-I的跨物种应用规避了真核GS的反馈抑制（如Mn²⁺依赖性调节），其结构特性（如狭窄双漏斗）可能增强选择压力。未来需关注下游纯化过程中细菌GS的清除特性。该技术为细胞株工程提供全新维度，有望成为生物制药生产的游戏规则改变者。