三唑-香豆素杂合体作为靶向细胞周期与凋亡的强效乳腺癌抑制剂的设计、合成及分子对接研究

这篇研究通过理性设计合成六种新型酰胺桥联三唑-香豆素杂合体（5a-f），发现化合物5f对MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌细胞具有显著选择性细胞毒性（IC50 15.7-22.1 μM），其通过下调CDK2/Cyclin E复合物诱导S期阻滞，并通过调控Bcl-2/Bax表达激活凋亡通路。分子对接证实5f与CDK2（-11.16 kcal/mol）和Bcl-2（-9.04 kcal/mol）的高亲和力结合，为开发双靶点乳腺癌治疗药物提供了先导结构。

　　

1 引言

乳腺癌作为女性最高发的恶性肿瘤，全球年新增病例达230万例（GLOBOCAN 2022数据），亟需高选择性低毒的新型治疗策略。分子杂合技术将香豆素（具有调控激酶、端粒酶等多靶点特性）与三唑（可调节CDKs和Bcl-2家族蛋白）两大药效团结合，通过协同作用克服单靶点药物局限性。本研究设计酰胺桥联的三唑-香豆素杂合体，旨在开发同时靶向细胞周期和凋亡通路的新型乳腺癌抑制剂。

2 结果与讨论

2.1 化学合成

通过三步反应构建目标化合物（Scheme 1）：首先将1a-f与肼单水合物反应生成中间体2a-f，随后3-氧代苯并[f]色烯-2-甲酸与SOCl₂反应生成酰氯3，最终与三唑衍生物缩合得到目标杂合体5a-f。代表性结构5f（Scheme 2）含氯原子取代，其分子量虽超500 Da，但类似紫杉醇等临床药物，仍具备成药潜力。

2.2 生物评价

2.2.1 细胞毒性

化合物5f对MDA-MB-231和MCF-7的IC₅₀分别为15.7±0.2 μM和22.1±0.42 μM（Table 1），对正常MCF-10A细胞的毒性显著降低（IC₅₀ 61.9±0.6 μM），选择性指数（SI）达3.9。结构-活性关系（Figure 1-2）显示：氯原子取代（5f）比甲基（5a）或乙基（5b）显著增强活性，而苯环扩展（5c-e）降低效力。

2.2.2 细胞周期调控

流式细胞术显示5f将MCF-7和MDA-MB-231阻滞于S期（G0/G1期细胞从54.5%降至0.8%，Table 2）。qRT-PCR证实CDK2和Cyclin E mRNA水平分别下调2.4倍和3.1倍（Figure 4），与临床S期阻滞剂作用机制一致。

2.2.3 凋亡诱导

5f处理72小时后，DNA断裂增加4.15倍（Figure 5），伴随Bcl-2表达下调3.1倍、Bax上调2.35倍（Figure 4），表明通过线粒体途径激活凋亡。这一结果与1,2,4-三唑-香豆素糖苷杂交体报道的机制相符。

2.2.4 分子对接

5f与CDK2的结合能达-11.16 kcal/mol（Table 3），通过氢键（Leu83、Asp86）和π-堆叠（Lys20/89）稳定结合（Figure 6）；与Bcl-2的相互作用（-9.04 kcal/mol）涉及Arg146氢键和Tyr108 π-堆叠（Figure 7），验证了其双靶点作用模式。

3 结论

酰胺桥联的三唑-香豆素杂合体5f通过双重机制——抑制CDK2/Cyclin E复合物诱导S期阻滞，以及调控Bcl-2/Bax比例触发凋亡，展现出显著的抗乳腺癌活性和选择性。其分子量虽超出传统"五规则"，但优异的体外活性和明确的靶点结合模式，为开发突破性乳腺癌治疗药物提供了新思路。

4 实验方法

合成采用核磁（¹H/¹³C NMR）和质谱（LC-MS）表征；细胞实验使用MTT法测定IC₅₀，流式细胞术分析周期，ELISA检测DNA断裂；qRT-PCR采用ΔΔCT法分析基因表达；分子对接使用Schrodinger Maestro软件，蛋白预处理采用OPLS-2005力场，结合能计算包含诱导契合效应。统计采用ANOVA与Tukey检验（p<0.05为显著）。