机器学习驱动的同源酶抑制剂特异性改造：基于N-TIMP2变体对MMP-9/3/1的选择性设计新策略

（编辑推荐）本研究通过机器学习（ML）整合高通量测序（HTS）数据，成功设计出对基质金属蛋白酶（MMP）-9具有高选择性、对MMP-3/1呈现差异结合的N-TIMP2变体（N-TIMP2MUT），其抑制常数（Ki）显示对MMP-9的选择性提升达106-121倍。该研究为同源酶系统的特异性抑制剂开发提供了可扩展的计算-实验联合范式。

　　

Abstract

选择性抑制剂在靶向治疗和酶功能研究中至关重要，但针对结构同源酶（如基质金属蛋白酶MMP家族）的设计面临巨大挑战。传统定向进化方法需构建庞大突变库且难以兼顾多靶点选择性。本研究提出机器学习（ML）驱动的新策略，通过分析N-TIMP2（组织金属蛋白酶抑制剂2的N端结构域）与MMP-1/3/9的结合数据，成功设计出具有差异结合特性的变体N-TIMP2_MUT（含Ser4Arg/Ser68Trp/Val71Trp等7个突变），其抑制常数K_i显示对MMP-9（2.341±0.116 nM）的选择性较MMP-3（248.3±65.6 nM）和MMP-1（283±45 nM）显著提升。分子模拟揭示突变通过重塑氢键网络（如Arg4与MMP-9 Lys184/Asp185相互作用）和芳香簇堆积（如Trp71与MMP-9 Phe192/Pro193）实现特异性调控。

Introduction

MMP家族在生理病理过程中发挥关键作用，但其高度保守的催化域（45%序列相似性）导致抑制剂设计困难。野生型N-TIMP2对MMP-1/9的K_i为0.11 nM，但对MMP-3亲和力低10倍，成为理想的工程模板。传统方法如深度突变扫描（DMS）仅能覆盖极小突变空间，而计算设计受限于能量函数精度。本研究创新性地将HTS数据与ML结合，通过预测log₂富集比（ER）筛选突变组合。

Results

预测与验证

ML模型在MMP-1/3低亲和力数据集表现优异（Pearson R=0.867/0.859）。从19⁷种可能变体中筛选的N-TIMP2_MUT在实验验证中展现出：

1. 1.

   对MMP-9抑制活性仅降低21倍（K_i从0.11→2.341 nM）

2. 2.

   对MMP-3/1抑制活性分别降低180倍和2572倍

3. 3.

   选择性指数（MMP-9 vs MMP-3/1）提升至106-121倍，远优于野生型的13倍

分子机制

能量最小化模型显示：

• •

  Ser4Arg：在MMP-9中形成K184/D185氢键网络，而在MMP-1中因Tyr210空间位阻丧失Gly178/Gly179氢键

• •

  Ser68Trp/Val71Trp：在MMP-9中与βIV链Phe192/Pro193形成稳定芳香簇，但在MMP-1中因Gln186阻碍导致结合能损失

• •

  AB-loop突变（Ile35Phe/Asn38Asp）通过间接效应影响选择性

Discussion

该方法较传统定向进化显著减少实验工作量，且可扩展至多酶系统。局限性包括：

1. 1.

   依赖HTS数据，突变位点受限（仅7个界面残基）

2. 2.

   整体亲和力有所牺牲，未来可结合语言模型优化

   结构动态性（如MMP活性环构象变化）未被充分建模，值得进一步探索。

Materials and Methods

技术亮点包括：

1. 1.

   酵母表面展示库：构建N-TIMP2七位点饱和突变库（含单/双突变）

2. 2.

   ML架构：双层感知机（FCL1=32神经元+ReLU激活）处理20×7氨基酸矩阵

3. 3.

   抑制动力学：采用Morrison方程拟合荧光底物（Mca-Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg-NH₂）水解数据

4. 4.

   分子模拟：YASARA力场500 ps能量优化，TIP3P水模型

（注：全文数据均来自原文实验验证，包括图4的SDS-PAGE纯化验证及图6-7的分子对接结果）