斑马鱼肠道神经系统发育的全肠空间基因组分析揭示分子区域化特征

本研究通过空间基因组分析(SGA)技术，首次在斑马鱼幼虫模型中构建了肠道神经系统(ENS)发育的3D转录组图谱。研究者整合4-7天(postfertilization, dpf)不同发育阶段的ENS空间与表达数据，鉴定出12个细胞群和hoxb5b、etv1等关键空间可变基因(SVGs)，揭示了ENS沿肠轴的分子区域化规律。该研究为先天性巨结肠(HSCR)等神经发育障碍疾病提供了重要数据基础。

　　

3D成像技术揭示ENS发育全景

采用创新的连续多重全mount杂交链式反应(HCR)技术，在4-7 dpf斑马鱼幼虫中实现了12个ENS标志基因的3D空间定位。通过机器学习辅助的细胞分割(IMARIS软件)获取单细胞分辨率的XYZ坐标和表达数据，首次构建出完整肠道包围的ENS网络结构。Z切片显示ENS细胞呈环形分布在肠管周围，phox2bb等基因在早期(4 dpf)即呈现全肠表达模式。

时空异质性的系统解析

应用Giotto分析框架整合多幼虫数据，通过harmony算法消除批次效应。UMAP降维与Leiden聚类鉴定出12个细胞群：群1-4主导早期(4 dpf)ENS且富集于后肠，群5-12构成晚期(7 dpf)ENS网络。值得注意的是，hoxb5b和hoxa4a在早期群体中高表达，而etv1在晚期群体特异性上调。细胞邻近性网络分析揭示早期ENS以群2-3间强异型相互作用为主，晚期则形成更复杂的同型连接网络。

关键调控因子的空间密码

空间相关性分析将12个基因分为5个共表达模块：nos1/vipb模块显示硝能神经元特征，hoxa4a/hoxb5b模块具有显著后肠偏好性。特别发现：

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  ret基因作为顶级SVGs在后肠波前持续活跃，印证其在ENPs迁移中的经典作用

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  etv1与ret呈现前-后肠表达互补，暗示RET-ETV1通路可能参与区域化神经元分化

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  hoxb5b从早期全肠表达演变为晚期前/中肠限制模式，其与elavl3的共表达提示Hox基因可能通过调控RNA结合蛋白影响神经元成熟

从3D网络到疾病启示

该研究首次描绘了ENS发育的立体转录组蓝图：早期(4 dpf)形成以hox基因为核心的简单网络，晚期(7 dpf)发展为包含oprd1b⁺等成熟神经元类型的复杂互联系统。特别值得注意的是，hoxa5a虽非差异表达基因(DEGs)，但作为SVGs可能通过空间定位调控微环境。这些发现为理解先天性肠神经病变（如HSCR中ENPs迁移阻滞）提供了新的分子视角，其建立的SGA流程也可拓展至其他神经发育障碍研究。