基因工程奥格塔酵母（Ogataea minuta）异源蛋白生产工艺优化及工业化应用研究

本研究通过构建缺失Prb1蛋白酶和酒精氧化酶（AOX1Δ）的双突变奥格塔酵母（O. minuta）宿主，优化碳氮源补料及pH控制等发酵条件，使人血清白蛋白（HSA）产量提升至7.5 g/L（21天生产期），并成功在4500 L生物反应器中实现候选生物药（靶向降钙素基因相关肽的脂质运载蛋白衍生物）工业化生产，为甲基营养型酵母规模化蛋白生产提供了重要范式。

　　

Highlight

本研究首次展示了基于奥格塔酵母（O. minuta）的双突变株（AOX1Δ/prb1::aph(4)）在工业化规模生产异源蛋白的潜力。通过精准调控发酵参数，该系统成功实现人血清白蛋白（HSA）的高效表达，并拓展至治疗性蛋白（如靶向CGRP的脂质运载蛋白衍生物）的4500升大规模生产，为甲基营养型酵母的产业应用树立了新标杆。

Section snippets

酵母菌株与培养基

本研究所用O. minuta生产菌株均衍生自tat06213和tat10113（表1）。通过导入质粒pOU1/PDER-PKA和pOMEA-Z1-10746/HSA，构建了共表达分子伴侣（Pdi1、Ero1、Kar2）的HSA生产菌株，同时引入ProteinX生产质粒进行功能验证。

突变株异源蛋白生产能力比较

前期研究发现，单独敲除酒精氧化酶（AOX1Δ）或蛋白酶Prb1（prb1::aph(4)）能提升蛋白产量。本研究进一步评估双突变株的协同效应，证明其作为异源蛋白生产宿主的优越性——在优化发酵条件下，HSA产量达7.5 g/L，且目标蛋白完整性显著提高。

讨论

酵母异源蛋白生产系统常面临蛋白酶介导的靶蛋白降解问题。与已报道的Komagataella phaffii（原Pichia pastoris）多蛋白酶缺陷株类似，O. minuta双突变株通过消除关键降解途径，为复杂生物药（如需要精确翻译后修饰的蛋白）提供了更稳健的生产平台。

作者贡献声明

Masashi Tsuda：研究设计、实验实施、论文初稿；Yuki Nakatani：实验操作；Satoshi Baba：项目监督；Koichi Nonaka & Takehiko Yoko-o & Yasunori Chiba：论文修订与学术指导。

致谢

本研究由第一三共株式会社自主开展，其中ProteinX系与Pieris Pharmaceuticals GmbH合作开发。