扩展全外显子测序技术在临床诊断中的应用：提升SNVs、SVs及线粒体变异检测的成本效益

为解决传统全外显子测序(WES)难以检测深部内含子、UTR（非翻译区）和结构变异(SVs)等问题，Fuyuki Miya团队提出扩展WES策略，覆盖日本医保基因列表和ACMG SF v3.2指南中基因的非编码区及70个重复扩增区域。实验证明该方法能以接近常规WES成本显著提升诊断率，缩短患者确诊周期。

　　

在遗传病诊断领域，全外显子测序(WES)因其对蛋白编码区(CDS)的高效覆盖而成为首选技术，但深部内含子变异、结构变异(SVs)和线粒体DNA(mtDNA)变异等"盲区"仍依赖昂贵的全基因组测序(WGS)。这种局限性导致约5%的致病变异被漏检，患者不得不面临漫长的"诊断马拉松"。更棘手的是，重复扩增疾病相关区域和线粒体异质性变异因技术难点长期未被纳入常规检测。

为突破这些瓶颈，Keio University School of Medicine的Fuyuki Miya团队在《Journal of Human Genetics》发表创新研究，提出"扩展WES"策略。该研究巧妙设计捕获探针，覆盖188个日本医保覆盖基因和81个ACMG SF v3.2基因的全长序列（含内含子和UTR），同时靶向70个疾病相关重复区域和完整mtDNA。通过调整探针浓度比例（如内含子区探针浓度降至标准WES的1/4），在仅增加20%测序数据量的前提下，将非编码区覆盖深度提升至≥10×的临床可用标准。

关键技术包括：1) 使用Twist Bioscience定制探针系统，对HG001/HG002标准样本进行对比验证；2) 采用Illumina NextSeq 500平台进行150bp双端测序；3) 整合GATK、DRAGEN和ExpansionHunter等多工具分析SNVs、SVs及重复扩增；4) 通过数字PCR验证线粒体异质性水平。

靶区覆盖评估显示：扩展WES对J-insurance基因内含子/UTR的覆盖从常规WES的<25%提升至>85%，且线粒体基因组在0.025×探针浓度下实现100%覆盖（深度≥200×）。

变异检测效能分析表明：在GIAB标准数据集验证中，扩展WES对非编码区变异的召回率从0.2跃升至0.9，F1分数从0.3提高到0.9以上（表2）。尤其值得注意的是，该方法成功检出常规WES漏诊的CHD7基因10.5kb缺失（图3A）、CREBBP基因14.5kb缺失（图3B）及DMPK基因CTG重复扩增（图3E-F）。

诊断案例验证中，m.3243A>G线粒体变异（37%异质性）的检测结果与数字PCR验证结果（38%）高度一致（图3D），证实该方法对低频率异质性变异的可靠性。

这项研究的突破性在于：首次系统整合临床必需的非编码区、重复扩增和mtDNA检测于单一WES方案，且成本仅增加20%。通过"精准扩展"靶区设计（而非全基因组覆盖），既避免WGS的高成本，又解决常规WES的关键盲区。研究者特别指出，该策略可根据临床需求灵活调整靶基因组合，例如针对神经科或心血管专科定制不同panel。

局限性在于GC含量极高区域（如FMR1基因CGG重复）的捕获效率仍有提升空间，且超长重复扩增仍需纳米孔测序验证。但毫无疑问，这项研究为缩短遗传病诊断周期树立了新标杆，其"按需扩展"的设计理念更为精准医学时代的基因检测提供了范式转移。