单分子实时可视化重构转录揭示RNAPII在单个启动子上的激活机制

研究人员开发了实时体外荧光转录(RIFT)技术，结合单分子全内反射荧光(smTIRF)显微镜，首次实现了在重构系统中对RNA聚合酶II(RNAPII)转录过程的秒级观测。该研究揭示了转录因子(HSF1)和中介体复合物(Mediator)通过其内在无序区(IDRs)协同调控RNAPII爆发式转录的分子机制，证明转录激活不需要相分离 condensate形成，为理解基因表达调控提供了全新视角。

　　

基因表达调控是生命科学的核心问题之一，其中RNA聚合酶II(RNAPII)介导的转录过程尤为关键。虽然过去几十年对转录预起始复合物(PIC)的组成和功能有了深入了解，但关于RNAPII如何在启动子上被快速激活、转录爆发(bursting)如何调控等基本问题仍不清楚。活细胞成像研究表明转录呈间歇性爆发模式，但受限于细胞环境的复杂性，难以揭示分子机制。此外，近年来关于相分离(phase separation)在转录调控中的作用存在激烈争论，转录因子(TFs)和中介体复合物(Mediator)等含有大量内在无序区(IDRs)的蛋白能否通过形成生物分子凝聚体(condensates)来调控转录尚不明确。

为解决这些关键问题，Megan Palacio和Dylan J. Taatjes团队在《Cell Reports》发表了创新性研究。他们开发了实时体外荧光转录(RIFT)技术，将生化重构与单分子成像完美结合，首次实现了对RNAPII转录过程的秒级观测。研究人员使用纯化的人源PIC因子，在天然HSPA1B启动子上重构转录系统，通过Peppers RNA适配体实时检测新生RNA，同时用smTIRF显微镜观察数百个启动子的转录活动。关键技术包括：1)建立RIFT系统实现转录实时可视化；2)单分子追踪技术分析TF和Mediator动态；3)构建含19个HSF1结合位点的修饰启动子；4)比较相分离condensate与单分子功能差异。

研究结果部分，作者通过多个精心设计的实验揭示了重要发现：

"TFIIE和TFIIH增加转录；TFIID加速第一轮RNAPII激活"表明完整PIC显著延长转录激活持续时间，Mediator和TFIID共同调控爆发大小(burst size)。

"HSF1和Mediator协同激活RNAPII"显示两者缺失导致转录大幅降低，协同指数分析证实其协同作用。非线性模型揭示至少两种重新起始机制。

"Mediator加速HSF1靶标搜索"实验模拟刺激响应条件，发现Mediator显著加快HSF1结合启动子速度，是快速激活的关键。

"无需TF-DNA结合的RNAPII激活"突破性发现Mediator可通过TF激活域(AD)直接招募TF到启动子，HSF1-AD和SREBP-AD均能激活转录。

"HSF1凝聚体与单分子功能无差异"表明相分离condensate并非转录激活必需条件。

"MED1-IDR可替代HSF1"实验显示Mediator的IDR区域具有转录激活功能，但动力学较慢，所有功能都依赖Mediator。

研究结论指出，RIFT技术为转录调控研究提供了全新视角。主要发现包括：1)Mediator和TF通过IDRs协同调控RNAPII爆发式转录，无需相分离condensate形成；2)增强子-启动子(E-P)远程激活可通过TF AD-Mediator相互作用实现；3)TF在启动子上的停留时间(dwell time)直接调控爆发大小；4)快速重新起始支持PIC支架(scaffold)模型。这些发现解决了领域内长期争议的问题，为理解基因表达调控提供了分子基础，对疾病相关转录异常研究具有重要启示意义。