单细胞长读长异构体解析研究揭示FTD患者脑组织中细胞特异性剪接失调

本研究针对颗粒蛋白缺乏性额颞叶痴呆(GRN-FTD)的剪接调控机制，采用创新的单细胞长读长测序技术SnISOr-Seq2，首次在单细胞分辨率下系统揭示了神经元和胶质细胞中TDP-43病理相关的剪接失调特征。研究发现30%的细胞类型特异性剪接变化会被传统批量测序掩盖，并鉴定出FTD相关外显子跳跃具有长度依赖性特征，为理解神经退行性疾病的分子机制提供了新视角。

　　

在神经退行性疾病研究领域，额颞叶痴呆(FTD)作为一种主要影响额叶和颞叶的进行性疾病，其分子机制仍有诸多未解之谜。颗粒蛋白(GRN)基因突变导致的FTD(GRN-FTD)占家族性FTD的5%-20%，与TAR DNA结合蛋白43(TDP-43)的异常聚集密切相关。尽管TDP-43的RNA结合特性提示其可能参与剪接调控，但不同脑细胞类型中的剪接失调模式及其与疾病进展的关系仍不清楚。传统批量测序技术无法解析细胞类型特异性的剪接变化，而培养细胞模型又难以完全模拟人脑中的复杂病理过程。这些限制使得研究者们难以全面理解GRN-FTD中剪接失调的细胞特异性及其对神经退行性变的贡献。

为突破这些技术瓶颈，Natan Belchikov、Wen Hu和Li Fan等研究者开展了一项开创性的单细胞分辨率研究。研究团队从6名GRN-FTD患者和6名对照者的死后脑组织中获取样本，采用优化的单核长读长RNA测序技术SnISOr-Seq2，靶向检测了3,630个与神经退行性疾病相关的基因。这项发表在《Cell Reports》上的研究首次在单细胞水平揭示了FTD相关的全转录组剪接失调图谱。

关键技术方法包括：1)从12例人脑样本(6例GRN-FTD和6例对照)获取单核悬液；2)开发SnISOr-Seq2技术，使用跨越剪接位点的探针组富集目标转录本；3)结合10x Genomics短读长测序和Oxford Nanopore长读长测序；4)建立分析流程检测细胞类型特异性剪接变化；5)使用独立样本通过RT-qPCR验证关键发现。

研究结果部分，多个重要发现被系统呈现：

"Sequencing and quality control"部分证实了技术可靠性，成功捕获了大脑皮层所有主要细胞类型，包括兴奋性神经元、抑制性神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞及其前体细胞、小胶质细胞和内皮细胞。FTD样本中少突胶质细胞比例显著增加(从对照的19.17%增至41.02%)。

"Gene expression patterns in FTD samples and controls"显示，不同细胞类型的基因表达变化模式各异。在兴奋性和抑制性神经元中，下调基因多于上调基因，而星形胶质细胞和少突胶质细胞则呈现相反趋势。GO分析揭示FTD兴奋性神经元中突触相关术语显著富集。

"Detecting splicing dysregulation in multiple neural cell types"部分报道了核心发现：FTD中更易被跳过的外显子(中位数57bp)比上调包含的外显子(中位数95bp)更短。转录因子TCF12中一个72bp外显子在神经元中呈现FTD特异性跳跃，其包含率从对照的71%降至病例的26-29%，接近星形胶质细胞的基线水平(22%)。

"Masking of cell-type-specific dysregulation in pseudobulk"揭示高达30%的细胞类型特异性剪接变化在批量分析中被掩盖。例如SLC25A26基因在星形胶质细胞中显示31%的ΔΨ，但在少突胶质细胞中接近零，导致批量分析无法检测。

"Splice-donor and-acceptor site dysregulation"鉴定出16-23个异常剪接位点使用事件，且受影响基因在供体和受体位点异常间无重叠。

"Cell-type-specific splicing dysregulation"部分发现最强剪接变化(|ΔΨ|≥45%)往往仅发生在特定细胞类型。PRUNE2基因在星形胶质细胞中呈现显著FTD相关外显子跳跃(包含率从79%降至30%)，而在神经元中变化较小。蛋白酪氨酸磷酸酶受体K(PTPRK)的外显子跳跃在抑制性神经元(ΔΨ=-53%)比兴奋性神经元(ΔΨ=-7%)更为显著。

"FTD-affected brain regions show enhanced splicing events"通过独立样本验证，发现FTD易感的额叶皮层比相对保留的枕叶皮层表现出更强的疾病相关剪接模式。病情更严重的病例1比病例2显示出更高比例的异常剪接事件。

"Splicing dysregulation in excitatory subtypes associated with distinct cortical layers"分析发现，与TDP-43病理分布一致，上层皮层(L2-3)的兴奋性神经元比深层(L4-6)表现出更多剪接失调事件。

研究结论部分强调，这项工作首次在单细胞分辨率下描绘了GRN-FTD中的剪接失调全景图，揭示了传统方法无法检测的细胞类型特异性变化。研究发现FTD中神经元可能转向胶质细胞的剪接模式，如TCF12外显子跳跃所示；鉴定出与疾病阶段和脑区易感性相关的剪接变化梯度；建立了细胞类型、皮层层次与剪接失调的关联框架。这些发现为理解TDP-43病理的细胞特异性效应提供了新视角，开发的技术平台可广泛应用于各类脑疾病研究。

研究的局限性包括无法分析已丢失的细胞类型，以及样本量受限于人脑组织的获取难度。未来研究可扩大样本规模，并探索这些剪接变化在其他TDP-43蛋白病(如ALS和阿尔茨海默病)中的普遍性。该工作不仅为GRN-FTD的机制研究开辟了新途径，也为开发针对特定细胞类型的治疗策略提供了分子靶点。