人类microRNA功能性质疑：半数注释miRNA表达量低于生物学功能阈值

本研究通过构建高灵敏度报告系统，首次将microRNA(miRNA)功能阈值量化为200 CPM（Counts Per Million），结合13,000+细胞/组织样本的小RNA测序数据，揭示超过50%的注释miRNA在生理条件下无法达到功能活性阈值。该发现发表于《iScience》，对纠正miRNA研究中的过表达假象具有里程碑意义，为领域建立了严格的表达量评估标准。

　　

在基因调控领域，microRNA(miRNA)作为重要的转录后调控因子已被广泛研究。然而随着miRBase数据库收录的"miRNA"数量突破2800个，学界对其真实功能产生两大争议：一是大量注释miRNA可能仅是RNA降解产物，二是多数研究依赖超生理剂量的外源表达来"证明"功能。这种现状导致文献中出现大量可能脱离生物学真实性的结论，例如超过6500篇论文以低表达miRNA（<100 CPM）作为研究对象。

为破解这一困局，澳大利亚南澳大学Cameron P Bracken团队在《iScience》发表突破性研究。研究人员首先构建了具有完全互补结合位点的超敏感报告系统，这种设计能通过AGO2(Argonaute 2)的切割活性放大信号。实验显示，即使对miR-21-5p（HeLa细胞第三高表达miRNA）这样的高丰度分子，完全互补报告基因的敏感性也远超天然8nt种子区匹配的报告系统。

关键技术包括：1）优化双荧光素酶报告系统（5ng转染量）；2）分析microRNAome和miTED数据库中13,000+样本的小RNA测序数据；3）结合miRGeneDB严格注释标准评估进化保守性；4）利用HMLE/mesHMLE细胞模型进行AGO结合效率验证。

构建敏感的内源性miRNA活性报告系统

通过对比完全互补与种子匹配报告基因，证实前者灵敏度提升10倍以上。在293T细胞中，尽管miR-21-5p仅排第27位（约2000 CPM），仍能抑制80%报告活性。滴定实验确定5ng转染量可在敏感性与可重复性间取得最佳平衡。

内源性miRNA活性在200 CPM以下不可检测

三组细胞系（HeLa、MDA-MB-231、HEK-293T）实验显示：

• ≥1000 CPM的miRNA均显示显著抑制（p<0.0001）

• 200-1000 CPM区间结果波动（如miR-374a-3p活性异常低）

• <200 CPM的miRNA均无统计学显著活性

多数miRNA从未达到功能表达水平

分析显示：

• 1565个miRNA（55.6%）在所有样本中<100 CPM

• 353个基因座产物<10 CPM

• 低表达miRNA与DROSHA加工效率低显著相关（p<0.001）

低表达miRNA多源于近期进化

miRGeneDB数据库分析揭示：

• 古老miRNA（>4.2亿年）100%>100 CPM

• 人类特异性miRNA中20%<100 CPM

• 非miRGeneDB注释的"miRNA"66%<100 CPM

这项研究建立了miRNA功能评估的金标准，证实当前miRNA研究中存在严重的过表达假象问题。其意义不仅在于纠正了半数miRNA注释的功能性质疑，更提出了三个评估维度：表达阈值（>200 CPM）、进化保守性、DROSHA加工效率。该成果将推动领域从"发现新miRNA"转向"验证真实功能"，对研究设计、论文评审及数据库建设具有深远指导价值。