"TetraVecta?系统：通过MSD突变和新型U1 snRNA增强子提升慢病毒载体的生产效率与安全性"

本研究针对第三代慢病毒载体(LV)在临床应用中存在的RNA异常剪接、转基因泄漏表达及产品安全性问题，开发了创新的TetraVecta?系统。通过突变主要剪接供体(MSD)位点和共表达靶向包装信号ψ的新型U1 snRNA增强子，显著减少了载体RNA(vRNA)的异常剪接形式，同时利用TRiP系统?有效抑制转基因蛋白表达。该技术使2KO-LV载体的病毒滴度提升7倍，并消除了靶细胞中异常剪接vRNA衍生的游离cDNA，为基因治疗产品提供了更安全高效的生产平台。

　　

基因治疗领域长期面临慢病毒载体生产效率与安全性的平衡难题。尽管第三代HIV-1衍生的慢病毒载体(LV)已具备Tat非依赖性等安全特性，但其基因组保留的复杂顺式作用元件仍会导致意外后果——主要剪接供体(MSD)频繁激活异常剪接事件，产生编码转基因但缺乏内部启动子的缺陷型载体RNA(vRNA)。这些"泄漏"的转录本不仅影响TRiP系统?的翻译抑制效果，更可能被包装入病毒颗粒并在靶细胞中形成游离cDNA，带来潜在安全隐患。

为系统解决这些问题，牛津生物医学公司的J. Wright团队在《Heliyon》发表重要研究。研究采用分子生物学技术构建MSD突变载体(2KO-LV)，通过高通量测序(RNAseq)和定量PCR(qPCR)分析vRNA剪接模式，开发靶向包装信号ψ的256U1[15 nt] snRNA增强子，结合质谱分析验证载体蛋白组成。利用流式细胞术评估CAR-T细胞功能，建立GMP级纯化工艺监测残余核酸清除效率。

主要剪接供体(MSD)活性导致大量异常剪接vRNA

研究发现第三代LV中MSD会与转基因序列中的强效/隐蔽剪接受体(cr-sa)错误配对，产生Δψ-RRE等异常剪接产物。RT-qPCR显示EF1α启动子驱动的载体中>95%转录本被剪接，即使存在Rev蛋白也无法完全抑制。将MSD与相邻隐蔽剪接位点(crSD1-3)突变的"2KO-LV"虽减少剪接，但病毒滴度降低6-100倍。

Tat或修饰U1 snRNA可挽救MSD突变载体的滴度

实验发现Tat或靶向ψ区域的修饰U1 snRNA(如305U1[9 nt])能使2KO-LV滴度恢复至野生型水平。机制研究表明这独立于5' poly-A位点抑制，且依赖U1 snRNA的Sm蛋白结合域。通过15nt互补序列优化获得的256U1 snRNA，与SL1-SL3区域结合时增强效果最佳，使2KO-LV滴度提升7倍。

2KO-LV消除异常剪接vRNA及其衍生的游离cDNA

RT-PCR证实第三代LV产物中含有MSD-EF1α剪接的vRNA，而2KO[m5]突变体则完全消除。qPCR显示转导细胞中，野生型LV产生的MSD-saEF1a cDNA拷贝数达10³/μg DNA，2KO-LV则检测不到。这解决了长期存在的载体基因组"泄漏"表达问题。

TRiP系统?在2KO-LV中实现最佳转基因抑制

当MSD活性导致转基因mRNA携带ψ区域序列时，TRAP蛋白对翻译起始的抑制效率降低。改进的kztktsV0.G型5'UTR-tbs序列与2KO-LV联用，使CAR蛋白在HEK293T-TRiP细胞中的表达降低至0.1%，质谱检测显示最终产品中几乎无转基因蛋白污染。

GMP级生产验证技术可行性

在200L生物反应器中，256U1增强的2KO-LV-CAR5T4经阴离子交换层析纯化后，宿主细胞蛋白残留<100ng/mL，256U1 snRNA与vRNA比例达1:1000。所得CAR-T细胞对靶细胞的杀伤效率与常规载体相当，证实技术安全性。

这项研究建立的TetraVecta?系统包含三大创新：通过2KOm5突变彻底阻断异常剪接；利用ψ靶向U1 snRNA克服滴度损失；优化TRiP系统?实现生产全程转基因抑制。该技术平台已成功应用于CAR-T细胞治疗和肝靶向基因治疗载体生产，为基因治疗产品的质量控制和监管合规提供了新标准。尤其对于需要高剂量全身给药的LV产品，消除异常剪接vRNA衍生的游离cDNA具有重要临床意义。