定向进化肝脏去靶向AAV载体实现骨骼肌和心脏系统性基因递送的技术突破

本研究针对AAV(腺相关病毒)基因治疗中高剂量系统给药导致的肝毒性风险，通过筛选天然血清型、靶向诱变和定向进化技术，成功开发出肝脏去靶向的肌肉趋向性AAV9.AAA.NVG7和AAV5.NVG13新型衣壳。研究证实这些载体在非人灵长类(NHP)模型中显著降低肝脏转导(AAV9.AAA.NVG7降低7倍)，同时提升骨骼肌(10倍)和心脏(17倍)mRNA表达，其结构特征通过冷冻电镜(cryo-EM)解析。该成果为杜氏肌营养不良等肌肉疾病提供了更安全有效的基因治疗载体选择。

　　

基因治疗领域长期面临一个关键挑战：当通过静脉注射递送腺相关病毒(AAV)载体时，这些载体往往会在肝脏中大量富集，导致肝毒性风险。这一问题在杜氏肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy)等需要全身给药的肌肉疾病治疗中尤为突出——临床使用剂量超过1×10¹⁴ vg/kg时，已报道多起严重肝损伤甚至死亡案例。传统AAV9载体虽然能有效转导肌肉组织，但其强烈的肝脏趋向性成为限制临床应用的安全隐患。

为突破这一瓶颈，Elad Firnberg团队在《Molecular Therapy Methods》发表的研究中，创新性地结合了天然血清型筛选、靶向诱变和定向进化三大技术策略。研究人员首先发现AAVhu.32和AAV5具有天然的肝脏去靶向特性，随后通过NAVIGATE(新型AAV智能引导适应进化)平台，在AAV9的VR-IV环插入七肽文库，经过两轮非人灵长类体内筛选，最终获得VQVGRTS(NVG7)和VRSDRDQ(NVG13)两个关键肽段。这些改造使载体在保持肌肉转导能力的同时，显著降低了肝脏趋向性。

关键技术方法包括：1)建立含10⁷多样性的肽段插入文库；2)在非人灵长类中进行三轮体内筛选(剂量1.75-3×10¹³ vg/kg)；3)采用条形码追踪技术定量各组织载体分布；4)通过冷冻电镜解析衣壳三维结构(分辨率达2.2?)；5)在mdx小鼠模型(杜氏肌营养不良模型)中验证治疗性microdystrophin基因递送效果。

自然血清型筛选揭示基础特性

通过比较118种AAV变体发现，AAV9.AAA(含N496A/N497A/N498A突变)在非人灵长类中显示48倍肝脏去靶向效果，而AAV5虽在骨骼肌中载体基因组(DNA)含量高，但mRNA表达水平低下。这为后续定向进化提供了理想骨架。

定向进化鉴定关键肽段

在VR-IV环455位点插入随机七肽的AAV9.AAA文库，经两轮筛选后，VQVGRTS(NVG7)肽段脱颖而出。冷冻电镜显示该肽段与相邻VR-V环存在"符号上位性"相互作用——AAA突变使VR-V环构象更紧凑，进而影响插入肽段的空间排布。这种结构协同作用解释了为何NVG7仅在AAA背景下表现最佳。

体内验证显示卓越性能

在mdx小鼠模型中，AAV9.AAA.NVG7携带microdystrophin基因时，肝脏转导比AAVhu.32降低4倍，而肌肉表达相当。RNAscope分析显示其骨骼肌细胞mRNA foci增加2倍。非人灵长类单载体研究证实，1×10¹⁴ vg/kg剂量下，该载体肝脏载体基因组比临床用AAV9降低6.9倍，且无显著肝酶升高。

意外发现神经元转导优势

令人惊讶的是，AAV9.AAA.NVG7将AAV9的星形胶质细胞趋向性转变为神经元特异性转导。在小鼠大脑皮层中，90%的tdTomato⁺细胞与神经元标记物NeuN共定位，而原始AAV9仅31%。这一特性为神经系统疾病的静脉给药提供了新可能。

这项研究通过多学科交叉方法，不仅开发出具有临床应用前景的新型载体，更揭示了AAV衣壳结构与功能的深层关系。AAV9.AAA.NVG7和AAVhu.32.AAA.NVG7的肝脏去靶化特性，有望显著降低基因治疗中的肝毒性风险；其增强的肌肉转导效率，则为杜氏肌营养不良等疾病的治疗提供了更优选择。特别值得注意的是，研究中发现的结构上位性效应为今后理性设计AAV载体提供了重要理论指导——VR-V环的构象变化可以远程调控VR-IV环插入肽段的功能，这一发现将推动更精准的衣壳工程设计。

从转化医学角度看，这些改良载体已显示出明确的临床转化潜力。相比当前临床使用的AAV9载体，新型载体在同等剂量下可实现相当的肌肉转导效果，同时大幅降低肝脏负担，这将直接提高基因治疗的安全性窗口。随着相关研究的深入，这些技术突破有望为多种遗传性肌肉疾病带来更安全有效的治疗方案。