含三对二硫键的S-糖基化糖肽素的结构表征与生物活性研究

本研究针对糖肽素（glycocins）这一核糖体合成翻译后修饰肽（RiPPs）家族，通过异源表达和AlphaFold3建模，成功表征了来自嗜热厌氧杆菌Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum的thermoglycocin和Ornithinibacillus bavariensis的orniglycocin。研究首次揭示这两种糖肽素含有三对二硫键和双N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）修饰，并发现其C39蛋白酶在非经典Gly-Lys位点切割前导肽的独特机制。该成果拓展了糖基转移酶的应用潜力，为糖肽素家族命名规范提供了新范式。

　　

在微生物天然产物领域，糖肽素（glycocins）作为核糖体合成翻译后修饰肽（RiPPs）的重要亚类，因其独特的O/S-糖基化修饰和抗菌活性备受关注。然而目前已知的糖肽素结构多样性有限，特别是含多对二硫键的S-糖基化成员更属罕见。传统C39蛋白酶对双甘氨酸（GG）切割位点的严格限制，也阻碍了新糖肽素的发现与表征。

为解决这些问题，Martini等研究者通过基因组挖掘，从嗜热厌氧杆菌Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum和Ornithinibacillus bavariensis中鉴定出两个新型糖肽素生物合成基因簇（BGC）。研究采用异源表达、质谱分析和AlphaFold3结构预测等关键技术，系统表征了thermoglycocin和orniglycocin的结构特征与生物合成机制。实验菌株来源于美国伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校的菌种库，关键质粒通过Twist Biosciences合成。

Identification of the thg BGC

通过序列相似性网络（SSN）分析糖基转移酶GccA同源蛋白，锁定thg和org两个BGC。这两个基因簇编码的 precursor peptide（ThgA/OrgA）分别含7/8个半胱氨酸，显著多于已知糖肽素（通常含5个Cys），预示其可能形成更复杂的二硫键网络。

Characterization of the glycocin produced by the Thg BGC

在大肠杆菌中异源表达显示，糖基转移酶ThgS/OrgS可催化ThgA/OrgA发生双GlcNAc修饰（质谱检测到+406 Da质量偏移）。通过N-乙基马来酰亚胺（NEM）烷基化结合蛋白酶解-质谱分析，确定thermoglycocin的修饰位点为Cys⁴⁴和Ser²⁰，orniglycocin则为Cys²⁴和Cys⁴⁸。

In vitro glycosylation of ThgA by ThgS

体外实验证实ThgS能以UDP-GlcNAc为底物完成糖基化。热蛋白酶解实验揭示thermoglycocin含三对二硫键（Cys⁷-Cys³⁰、Cys¹⁴-Cys²³和Cys⁴¹-Cys⁴⁶），形成与glycocin F相似的嵌套结构，但额外增加C端环状二硫键。

Prediction of the leader peptide cleavage site

AlphaFold3建模突破性发现：尽管ThgA缺乏经典GG切割位点，但其疏水残基Ile^-9/Leu^-14能与ThgT蛋白酶域形成新型结合模式，预测切割发生在Gly-Lys（GK）位点。

Reconstitution of the C39 protease domain of OrgT

实验验证OrgT₁₅₆确实在GK位点切割mOrgA/mThgA（质谱检测到预期大小的核心肽），首次证实C39蛋白酶可识别非经典切割位点。

Bioactivity testing

Orniglycocin对Bacillus cereus和B. subtilis表现出显著抗菌活性，而thermoglycocin可能因宿主菌的嗜热特性导致活性谱差异。

这项发表于《Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology》的研究具有多重意义：①发现首例含三对二硫键的糖肽素，拓展结构多样性；②揭示糖基转移酶ThgS/OrgS兼具O/S-糖基化能力的分子基础；③突破C39蛋白酶切割位点的传统认知，为基因组挖掘提供新标准；④提出糖肽素命名统一方案（GycA/GycS/GycT）。这些发现不仅深化了对糖肽素生物合成的理解，其稳定的S-糖苷键更为糖工程应用提供了新工具。