螯合剂、表面活性剂与镁离子对LPS聚集体尺寸的影响及其在低内毒素回收现象中的作用机制研究

为解决药品中内毒素检测时出现的低内毒素回收(LER)现象，研究人员通过动态光散射(DLS)和小角X射线散射(SAXS)系统研究了螯合剂、表面活性剂及Mg2+对脂多糖(LPS)聚集体尺寸的影响。结果表明，表面活性剂单独作用可减小LPS聚集体尺寸，而螯合剂单独作用无显著影响；两者联用(LER条件)则协同增强尺寸缩减效应，但Mg2+能抑制该效应。研究挑战了"LER仅由聚集体尺寸减小引起"的传统观点，为揭示LER机制提供了新视角。

　　

在药品质量控制领域，内毒素检测如同守护患者安全的"哨兵"，而Limulus阿米巴细胞裂解物(LAL)检测则是当前公认的"黄金标准"。然而2013年Chen和Vinther报道的"低内毒素回收(LER)"现象——即已知浓度的内毒素在药品基质中随时间推移逐渐无法被LAL检测——给这一标准蒙上了阴影。更令人担忧的是，这些"隐形"的内毒素仍能引发人体强烈的免疫反应，犹如潜伏的"特洛伊木马"。研究发现，LER与药品配方中同时存在的螯合剂和表面活性剂密切相关，但关于其分子机制却存在激烈争议：究竟是内毒素聚集体被解离成单体，还是其表面特性发生了改变？

为破解这一谜题，曼彻斯特大学的Amy Gorman团队在《European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics》发表研究，首次系统考察了多种LER条件下内毒素聚集体的结构变化。研究人员采用动态光散射(DLS)和小角X射线散射(SAXS)双管齐下，在模拟真实药品浓度(10 mg/mL)的未稀释样本中，分析三种螯合剂(EDTA、柠檬酸盐、磷酸盐)与三种表面活性剂(PS-20、PS-80、Triton X-100)单独或组合作用对大肠杆菌O55:B5 LPS的影响，并探究Mg²⁺的调节作用。温度梯度实验(25-75°C)和重复验证确保了数据可靠性，SAXS还通过DAMMIF算法构建了聚集体三维模型。

LPS聚集体尺寸分布特征

DLS揭示所有样本中均存在10-100 nm(主)和100-1000 nm(微量)两类聚集体。质量分析显示>95%的LPS以较小聚集体形式存在，这一发现纠正了过去研究可能被微量大聚集体干扰的误区。温度实验证实升温不会导致聚集体解离，但不同配方显著影响尺寸：表面活性剂使聚集体缩小约30%，而螯合剂单独作用几乎无效。引人注目的是，螯合剂与表面活性剂联用(LER条件)产生协同效应，使聚集体进一步缩小，其中Triton X-100+EDTA组合效果最强。

镁离子的"保护盾"效应

当添加与螯合剂等量的Mg²⁺(10 mM)时，出现戏剧性转变：表面活性剂的尺寸缩减作用被显著抑制，尤其在含磷酸盐的配方中。但EDTA因螯合能力更强，其配方中Mg²⁺的"救援"效果较弱。这表明二价阳离子的保护效果取决于螯合剂类型和相对浓度，为理解不同药品配方中LER表现的差异提供了分子基础。

聚集体形貌的"不变性"

SAXS构建的三维模型显示，所有条件下LPS聚集体均保持"蘑菇状"基本形态，仅按比例缩放。R_g(回旋半径)和D_max(最大尺寸)的变化趋势与DLS高度一致，交叉验证了结论可靠性。特别值得注意的是，某些非LER条件(如仅含表面活性剂)也能显著减小聚集体尺寸，这直接挑战了"尺寸减小必然导致LER"的假说。

这项研究通过多维度实验数据，确立了三个颠覆性认知：首先，LER条件下LPS聚集体虽尺寸减小但未解离为单体；其次，Mg²⁺的抑制作用具有配方特异性；最重要的是，聚集体尺寸变化与LER无必然因果关系。这提示未来研究应转向聚集体表面特性(如LPS分子排布密度)或动态重构过程。正如作者强调，将LER简单归因于"螯合剂+表面活性剂"的组合过于粗略，实际效应取决于具体化学性质与配比。该发现不仅为完善药品内毒素检测规范提供理论依据，更为生物制剂开发中的配方优化指明了风险规避方向。