西尼罗河病毒基因组CpG与UpA二核苷酸增加对库蚊传播及脊椎动物宿主致病性的影响

这篇研究通过同义重编码技术增加西尼罗河病毒（WNV）基因组中CpG和UpA二核苷酸频率，系统评估了其对库蚊（Culex pipiens）传播效率及小鼠模型神经侵袭性的影响。结果表明，UpA富集显著减弱病毒在蚊媒和脊椎动物细胞中的复制（P<0.05），而CpG增加仅影响脊椎动物宿主；UpA-high突变体在小鼠中表现出75%存活率并诱导免疫保护，但突破性感染仍导致与野生型相当的脑部病毒载量，提示二核苷酸操纵作为减毒疫苗策略需谨慎评估神经侵袭风险。

　　

Dinucleotide suppression patterns in flaviviruses correlate with host and vector specificity

通过构建黄病毒属系统发育树发现，脊椎动物感染性黄病毒（如WNV、ZIKV）同时抑制CpG（O/E=0.38-0.62）和UpA（O/E=0.43-0.60）二核苷酸，而昆虫特异性病毒仅抑制UpA。值得注意的是，伊蚊传播病毒比库蚊传播病毒表现出更显著的CpG抑制（P<0.001），提示不同媒介对病毒进化压力存在差异。

Construction of West Nile virus mutants with increased CpG and UpA dinucleotides

选择WNV基因组NS3-NS5区域（共3,287bp）设计突变体：SCR（野生型频率对照）、CpG1+2（增加96个CpG）、UpA1+2（增加108个UpA）及CpGmax/UpAmax（局部密集突变）。所有突变体保持野生型氨基酸序列，CpGmax因GC含量升高（60.2% vs 野生型51.5%）成为唯一单核苷酸频率改变的变体。

Replication in mosquito cells and vectors

在库蚊细胞系（C.pip/CxT）中，UpA-high突变体复制显著减弱（UpA2组P<0.05），而CpG突变体与野生型无差异。活体库蚊实验显示：UpA1+2组中位病毒载量降低10倍（P<0.05），但CpGmax组虽感染率降至40%，阳性样本病毒滴度仍达10^5.6 TCID₅₀/mL，接近野生型水平（10^6.2），证实UpA富集对蚊媒传播的全局抑制效应更显著。

Attenuation mechanisms in vertebrate systems

脊椎动物细胞实验揭示双重限制机制：

1. 1.

   CpG依赖途径：A549细胞中CpGmax滴度降低100倍（P<0.001），但在ZAP敲除细胞中完全恢复，证实锌指抗病毒蛋白（ZAP）的关键作用；

2. 2.

   UpA非经典途径：UpA2在Vero细胞中滴度下降10倍（P<0.001），ZAP敲除仅部分挽救，提示存在未知RNA降解通路。人iPSC神经元模型显示，皮质神经元-星形胶质细胞共培养体系中CpG1+2/UpA1+2复制减弱100倍（P<0.01），而运动神经元中仅UpA1+2轻微减弱，反映神经细胞亚型特异性应答差异。

Mouse pathogenesis and vaccine implications

C57BL/6小鼠模型中：

• •

  CpG1+2组虽死亡延迟2天（P<0.05），但最终100%死亡且脑部病毒载量（10³-10⁸ TCID₅₀/g）与野生型无差异；

• •

  UpA1+2组75%存活，幸存者血清IgG滴度显著升高，挑战实验显示完全抵抗野生型WNV攻击。值得注意的是，死亡个体脑病毒载量仍达野生型水平，RNA测序证实突变体在体内保持遗传稳定性，未出现回复突变。

Discussion

该研究首次阐明：

1. 1.

   库蚊传播的WNV对CpG富集耐受性高于伊蚊传播的ZIKV，反映病毒-媒介共进化特异性；

2. 2.

   UpA操纵在蚊媒和脊椎动物中均能有效减毒，但突破血脑屏障后仍可能导致神经侵袭；

3. 3.

   二核苷酸疫苗设计需平衡免疫原性与神经毒性，未来或需结合CpG/UpA双突变策略增强安全性。这些发现为黄病毒减毒疫苗开发提供了重要分子基准。