基于四重定量PCR的牛肝脓肿主要病原菌定量分析及其与瘤胃和结肠上皮组织的相关性研究

本研究开发了一种创新的四重定量PCR（qPCR）检测方法，用于精准量化牛肝脓肿（LA）及其匹配瘤胃（RT）和结肠上皮组织（CT）中四种关键病原菌：坏死梭杆菌亚种（FNN/FNF）、化脓性真杆菌（TP）和肠沙门氏菌（SE）。结果显示FNN在肝脓肿中占主导（浓度达7.0 log10 CFU/g），而TP和SE的贡献有限。该研究为理解多微生物感染的病原学机制提供了重要数据支持。

　　

ABSTRACT

牛肝脓肿（LA）是一种多微生物感染，主要涉及四种细菌病原体：坏死梭杆菌亚种necrophorum（FNN）和funduliforme（FNF）、化脓性真杆菌（TP）以及肠沙门氏菌（SE）。本研究通过开发四重qPCR检测方法，量化了384例LA、374例瘤胃上皮（RT）和256例结肠上皮（CT）组织中这些病原体的丰度。结果显示，FNN在肝脓肿中占绝对优势（检出率85.9%，浓度7.26 log₁₀ CFU/g），而TP虽检出率较高（29.2%），但浓度显著较低（5.89 log₁₀ CFU/g），SE则未被定量检出。

INTRODUCTION

肝脓肿对肉牛产业造成重大经济损失，其发生与瘤胃上皮损伤导致的细菌易位相关。传统培养方法难以评估多微生物感染中各菌种的贡献。本研究假设病原体在脓肿中的丰度可反映其致病作用，因此建立qPCR技术以实现精准定量。

MATERIALS AND METHODS

实验针对四种病原体的特异性基因设计引物和探针：FNN/FNF靶向lktA基因启动子区，TP靶向plo基因，SE靶向invA基因。通过172株菌株验证特异性后，检测下限确定为10²-10³ CFU/mL。样本来自三个独立育肥场研究，采用MagMax-96试剂盒提取DNA，通过混合线性模型进行统计分析。

RESULTS

在肝脓肿中，FNN单独检出率为47.7%，显著高于FNF（16.9%）。两者共存时浓度保持稳定（7.01和6.91 log₁₀ CFU/g）。瘤胃组织中FNF检出率（73.3%）显著高于结肠组织（9.0%），且浓度更高（5.36 vs 4.82 log₁₀ CFU/g）。值得注意的是，24例胃肠组织FNN阴性个体仍出现肝脓肿感染，提示可能存在其他感染途径。

DISCUSSION

研究首次系统量化了四种病原体在肝脓肿中的动态分布。FNN的高浓度支持其作为主要病原体的地位，而TP的低丰度表明其可能为继发感染。SE虽经培养法检出，但qPCR未检测到定量浓度，质疑其实际致病作用。瘤胃组织作为主要菌源的地位通过定量数据得到强化，而结肠组织的低携带率提示其贡献有限。

CONCLUSIONS

四重qPCR技术为牛肝脓肿的病原学诊断提供了新工具。FNN亚种（尤其是necrophorum）被确认为核心病原体，其定量数据为开发针对性防控策略奠定了理论基础。该研究同时揭示了传统培养方法在TP检测中的局限性，强调了分子技术在复杂微生物群落研究中的优势。