GPCR生物传感器在药物发现中的构象动力学与信号转导研究进展

这篇综述系统阐述了G蛋白偶联受体（GPCR）生物传感器技术的最新进展，重点介绍了基于转录报告系统（如Tango/PRESTO-Tango）、共振能量转移（RET）技术（FRET/BRET）和基因密码子扩展（GCE）等创新方法在GPCR构象变化、G蛋白激活（Gα-GTP形成）和β-arrestin招募研究中的应用。文章强调这些技术通过正交性设计、高通量筛选和微型化平台（如ONE-GO/TRUPATH）推动GPCR靶点药物发现，为解析30%已上市药物靶点的动态信号机制提供关键工具。

　　

1. 引言

作为人类基因组中最大的膜蛋白超家族，G蛋白偶联受体（GPCR）包含约750个成员，通过七次跨膜螺旋结构感知从生物胺到趋化因子等多样配体。GPCR通过异源三聚体G蛋白（G_αβγ）和β-arrestin介导信号转导，其动态平衡涉及GDP/GTP交换、腺苷酸环化酶（AC）调控等复杂机制。尽管冷冻电镜和分子动力学模拟已解析静态结构，但细胞环境中实时监测GPCR激活仍依赖生物传感器技术，这对开发靶向30%已上市药物的受体至关重要。

2. 生物传感器设计原则

理想的GPCR生物传感器需兼顾信号正交性（如避免内源干扰）、可扩展性（如384孔板筛选）和动力学分辨率。技术路线分为两类：研究分子间相互作用的转录报告系统（如β-arrestin招募）和监测分子内构象变化的RET探针。关键突破包括：

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  转录报告系统：Tango assay模仿Notch信号通路，通过烟草蚀纹病毒（TEV）蛋白酶切割释放转录激活因子tTA，首次实现AVPR2受体与β-arrestin2相互作用的定量检测。

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  微型化平台：PRESTO-Tango通过模块化载体库（含FLAG标签和V2尾序列）实现167种GPCR的高通量筛选，成功发现降糖药那格列奈可激活孤儿受体MRGPRX4。

3. 转录型生物传感器

3.1 哺乳动物系统

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  GPCRprofiler：结合分裂TEV蛋白酶（NTEV/CTEV）与EXT条形码，通过下一代测序（NGS）实现19种GPCR的混合筛选，但存在假阴性率高的局限。

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  PRESTO-Salsa：将DNA条形码与绿色荧光蛋白（GFP）报告基因耦合，在单孔中平行检测200种GPCR，应用于肠道菌群代谢物-受体互作图谱构建。

3.2 酵母系统

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  深突变扫描：在酿酒酵母中表达1,205个人视紫红质（Rho）突变体，通过mCherry报告基因鉴定影响9-顺式视网膜结合的折叠缺陷位点。

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  病原体检测：将白念珠菌STE2受体导入酵母，通过类胡萝卜素显色开发 dipstick 式诊断工具。

4. RET技术突破

4.1 FRET探针

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  构象监测：在甲状旁腺激素受体（PTHR）第三胞内环插入青色荧光蛋白（CFP），C端标记黄色荧光蛋白（YFP），发现激动剂诱导的构象变化时程比ADRA2A慢3倍。

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  小分子标记：FlAsH/ReAsH染料靶向四半胱氨酸标签（CCPGCC），实时捕捉β₂-AR激活时β-arrestin的多步构象重排。

4.2 生物正交标记

基因密码子扩展（GCE）通过琥珀终止密码子（UAG）插入非天然氨基酸（如对叠氮苯丙氨酸azF），结合SPIEDAC点击化学在生长激素释放肽受体（GhrR）胞内环定点偶联Alexa647，揭示组成性激活态的构象异质性。

5. BRET技术演进

5.1 经典应用

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  二聚化研究：β₂-AR的N端融合Rluc与YFP，证实激动剂促进受体同源二聚化。

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  信号偏倚：μ阿片受体（μ-OR）的24种配体通过10种BRET传感器聚类，预测药物副作用谱。

5.2 新一代平台

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  TRUPATH：开源14种G_αβγ生物传感器，量化G_i/G_q/G_12/13亚型解离动力学。

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  ONE-GO：单载体系统整合KB1691肽-Nluc与G_α-Venus，通过慢病毒递送实现HeLa细胞的内源G_αs-GTP检测，动态范围提升8倍。

6. 结论与展望

GPCR生物传感器已从单一β-arrestin报告基因发展为覆盖转录组学、蛋白质互作和构象动力学的多维工具箱。未来方向包括：① CRISPR/Cas9编辑内源位点（如CXCR4-HiBiT）消除过表达干扰；② 整合人工智能解析BRET信号模式与药物偏倚关联；③ 开发微流控芯片实现单细胞水平GPCR信号全景分析。这些进展将加速孤儿受体解码和变构药物开发，推动精准医疗时代的GPCR靶向治疗。