振动光谱与荧光显微镜的融合：突破单分子检测极限的化学成像新范式

这篇综述系统阐述了振动编码荧光显微技术（VEFM）如何通过双共振过程整合拉曼/红外光谱（SRS/IR）的化学特异性与荧光显微（FL）的超高灵敏度，突破传统振动光谱的检测极限。文章详述了刺激拉曼激发荧光（SREF）、荧光编码红外光谱（FEIR）等关键技术发展，实现了室温下单分子振动检测（SMVS）和超分辨成像（～0.3 μm），为生物分子互作、细胞异质性等研究提供了全新工具。

　　

振动光谱与荧光显微镜的融合：双共振技术突破

传统振动光谱（如拉曼/红外）虽具化学特异性，但灵敏度受限；荧光显微（FL）虽有单分子检测能力，却缺乏化学键信息。近年发展的振动编码荧光显微技术（VEFM）通过双共振过程将二者优势结合：利用振动激发（拉曼或红外）选择性调制荧光信号，实现"化学键可视化的荧光检测"。

拉曼编码荧光显微技术

早期由Wright提出的刺激拉曼激发荧光（SREF）概念，因双光子荧光背景干扰沉寂数十年。2019年研究突破电子预共振平衡：当激发总能量（ω_p-ω_s+ω_p）处于荧光团0-0跃迁20 nm范围内时，Rh800的氰基振动（～2,220 cm^-1）信号可达背景的30%。时域技术如FLETCHERS通过飞秒脉冲干涉消除背景，而频域调制（FM-SREF）结合STED实现超分辨成像（分辨率提升2倍），首次获得DNA的纳米级化学成像。

红外编码荧光技术

FEIR光谱利用飞秒红外脉冲序列实现香豆素6单分子检测（1 nM，1,620 cm^-1），BonFIRE显微则通过皮秒脉冲在"细胞静默区"（2,170-2,220 cm^-1）实现GFAP/MAP2双色标记。宽场MD-WISE技术通过三维参数（λ_vis/ω_IR/t）区分量子点（QD）与碘化丙啶（PI）标记的细胞结构，视频级成像速度展现活细胞应用潜力。

突破性应用进展

单分子振动成像：Rh800同位素体（¹³C≡¹⁴N/ ¹²C≡¹⁵N）在油水界面测得10⁷ V/cm电场，揭示微滴反应加速机制；活细胞氰基频移（～8 cm^-1）图谱显示核区结合水比例高于胞质。超多路复用方面，BF1探针4种同位素体实现EdU四色成像，而SREF对酵母细胞壁/质膜双标记灵敏度达单分子水平。

未来挑战与机遇

探针设计需平衡振动-电子耦合效率与细胞兼容性，如氰基寿命（0.5-4 ps）可反映局部电场但受溶剂重组能影响。热效应管理成为关键——MIR区水吸收可能引起～1 K/脉冲温升，需通过D₂O替换或兆赫兹激光降低热累积。理论计算预测苯乙炔衍生物的振动弛豫通路，为理性设计探针提供新方向。

这项技术正重塑化学成像范式：通过"振动指纹识别+荧光放大"的组合，使单分子水平的化学键观测如同荧光蛋白标记般直观，为生物医学研究开辟从分子异质性到亚细胞器化学动态的全新观测维度。