纳米孔传感耦合酶切技术实现EGFR-L858R低频突变的高灵敏度检测

本文创新性地将T7核酸内切酶I（T7E1）特异性酶切与纳米孔传感技术相结合，开发了一种检测表皮生长因子受体（EGFR）基因L858R点突变的新方法。通过磁珠探针靶向捕获、酶切富集和500 mV优化电压下的纳米孔检测，实现了0.1%超高灵敏度的单核苷酸变异（SNV）检测，为肿瘤精准诊断提供了更简便经济的解决方案。

　　

引言

癌症作为全球主要致死病因，其发生发展与单核苷酸变异（SNV）密切相关。EGFR基因21号外显子的L858R错义突变（胸腺嘧啶→鸟嘌呤）在非小细胞肺癌（NSCLC）等恶性肿瘤中占比高达41%，该突变通过将亮氨酸替换为带正电荷的精氨酸，使EGFR激酶催化效率提升20-50倍。尽管二代测序（NGS）和数字PCR（dPCR）等技术已用于SNV检测，但仍存在成本高、操作复杂或灵敏度不足等局限。

材料与方法

研究团队设计130 bp生物素化探针，通过链霉亲和素磁珠捕获EGFR/L858R异源双链。利用T7E1酶在37°C下特异性识别并切割单碱基错配位点（C碱基偏好性），产生的46 bp片段经磁分离后，在3 nm固态纳米孔中检测。通过电导公式G = σ(4L/πd²+1/d)^-1计算孔径，优化发现500 mV电压下可获得1,091.92±8.63 pA的稳定阻断电流信号。

结果与讨论

异源双链形成与酶切验证

凝胶电泳显示T7E1能特异性切割含L858R突变的异源双链（0.1 μM最低检测浓度），而野生型EGFR同源双链保持完整。酶切30分钟即达最大效率，延长至1小时未显著提升。

磁珠靶向富集

KRAS基因对照实验证实探针特异性。磁分离后，仅含L858R样本在纳米孔检测中产生特征性电流脉冲（1,125.27±5.50 pA），野生型样本无信号。

超敏检测性能

梯度稀释实验表明，该方法可检测低至0.1%突变频率的L858R，优于NGS的0.5%检测限。阻断电流持续时间0.19±0.01 ms，事件频率与突变浓度呈正相关。

结论

该技术通过"磁珠富集-酶切放大-纳米孔传感"三级级联策略，突破传统方法在灵敏度、成本和操作复杂度上的局限。未来通过优化探针设计，可扩展至BRCA、KRAS等癌症相关SNV检测，为液体活检和精准医疗提供新工具。