新型M23肽酶Pgp4/5/6调控空肠弯曲杆菌螺旋形态的分子机制及其致病性研究

这篇研究揭示了空肠弯曲杆菌(C. jejuni)中三种新型M23肽酶(Pgp4/5/6)通过调控肽聚糖(PG)水解活性决定细菌螺旋形态的分子机制。研究通过PG水解实验证实Pgp4/5具有DD-羧肽酶/内肽酶双重活性，而Pgp6是首个被鉴定的仅具DD-羧肽酶活性的M23家族成员。AlphaFold结构预测发现Pgp6特有的四个插入序列(SEQ1-4)可能通过限制活性位点空间而决定其底物选择性。基因缺失实验表明这三种酶通过不同方式影响细菌弯曲度，进而差异化调控运动性、生物膜形成、自聚集、酸耐受及上皮细胞侵袭等致病相关表型，为理解细菌形态-致病性关联提供了新视角。

　　

【M23肽酶Pgp4/5/6的功能解析】

空肠弯曲杆菌的螺旋形态由其肽聚糖(PG)层维持，这一特征与其致病性密切相关。研究团队通过蛋白纯化与PG水解实验，首次系统鉴定了三种含M23结构域的PG水解酶：Pgp4(CJJ81176_1105)和Pgp5(CJJ81176_1228)表现出DD-羧肽酶(切割末端D-Ala)和DD-内肽酶(水解4-3交联)双重活性，而Pgp6(CJJ81176_0166)仅显示DD-羧肽酶活性，成为M23超家族中首个被报道的单一功能成员。金属螯合实验证实三者均为锌依赖性金属蛋白酶。

【Pgp6底物选择性的结构基础】

通过AlphaFold建模和比较基因组学，研究发现Pgp6的M23结构域含有四个独特插入序列(SEQ1-4)。其中SEQ1包含保守模体Fx₃Nx₃Rx₂Nx₃I，SEQ3/4含关键芳香族残基Y324/W437。结构预测显示这些序列形成"分子门闩"机制：SEQ1/3延伸的α2螺旋和β片层构成封闭式活性位点入口，仅允许单体五肽进入；SEQ2/4则通过氢键网络（如I298-P188/Y189，N441-S151）稳定结构域间相互作用。这种精巧的空间限制解释了Pgp6为何不能水解二聚体底物。

【形态-功能关联的实验验证】

基因缺失株实验显示：

• ?pgp4：弯曲度降低，生物膜形成减少2.7倍(第3天)，CFW荧光减弱，自聚集加速

• ?pgp5：角度增加，运动性降至野生型85.1%，生物膜增加1.5倍，上皮细胞侵袭减弱14.8%

• ?pgp6：弯曲度减小，五肽含量从1.4%飙升至6.9%，向球状体转化延迟

值得注意的是，三种突变株均表现出独特的致病特征：?pgp5在Sigirr^-/-小鼠模型中保持野生型致病力，而此前研究的杆状突变体?pgp1/pgp2完全丧失致病性，提示螺旋曲度（而非绝对形态）才是决定致病性的关键参数。

【生理功能的差异化调控】

深入表型分析揭示：

• 运动性：?pgp5的显著缺陷可能与改变的角度影响鞭毛解缠绕效率有关

• 生物膜：?pgp4的CFW低荧光提示PG可及性改变，而?pgp5的生物膜增强独立于CFW反应

• 环境适应：pgp5/pgp6过表达株在pH5.0存活率下降，可能与金属酶活性受pH影响相关

• 形态转换：所有突变株均阻滞在球状体转化中期，暗示M23酶参与PG重塑的时序调控

这些发现不仅完善了对ε-变形菌门形态发生机制的理解，更为开发针对细菌形态调控通路的新型抗菌策略提供了理论依据。特别是Pgp6独特的结构特征，可能成为特异性抑制剂的理想靶点。