鸡肺源性microRNA靶向禽流感病毒PB2（片段1）的分子机制与抗病毒策略研究

这篇研究通过生物信息学分析筛选出鸡肺组织中靶向H5N1禽流感病毒PB2基因（RNA依赖性RNA聚合酶复合体关键亚基）的5种microRNA（gga-miR-17-3p、gga-miR-29a-5p等），揭示了宿主miRNA通过种子序列互补、热力学稳定性及靶位点可及性等机制抑制病毒复制的分子基础，为开发基于宿主固有免疫的禽流感防控策略提供了新思路。

　　

ABSTRACT

高致病性禽流感（HPAI）H5N1亚型因其在禽类中引发严重肺损伤和高死亡率而成为全球禽业重大威胁。研究聚焦病毒RNA聚合酶复合体关键组分PB2基因（片段1），通过分析200个H5N1感染鸡肺组织差异表达的microRNA（miRNA），发现gga-miR-17-3p等5种miRNA可通过特异性靶向PB2转录本，其作用机制涉及种子序列7mer/8mer位点互补、杂交自由能（MFE<-12 kcal/mol）及靶位点二级结构可及性。Circos图谱显示这些miRNA结合位点高度保守（跨63株H5N1分离株的95%序列），其中gga-miR-1718因最低可及性能量（ΔΔG）被列为最优候选分子。

1 Introduction

H5N1病毒通过PB2-627K等突变增强哺乳动物适应性，其PB2蛋白不仅参与病毒mRNA"帽状结构窃取"机制，还能与线粒体抗病毒信号蛋白（MAVS）互作干扰干扰素表达。鉴于传统疫苗因病毒抗原漂移失效，而转基因禽类存在伦理争议，研究转向宿主固有免疫元件——22nt非编码miRNA。既往发现鸡肺中miR-29a可抑制A型流感病毒复制，本研究通过系统筛选肺组织差异miRNA库，探索其靶向PB2的分子基础。

2 Materials and Methods

2.1 靶序列选择

采用印度H5N1毒株（KT867365）PB2全长编码序列，通过四步筛选流程：

1. 1.

   热力学稳定性：RNA22 v2.0预测miRNA-mRNA异源双链MFE≤-12 kcal/mol；

2. 2.

   种子序列互补：按7mer-A1/8mer等6类功能位点分类；

3. 3.

   保守性分析：MEGA11比对亚非欧美63株H5N1 PB2序列；

4. 4.

   靶位点可及性：mfold评估全局/局部（220nt窗口）RNA折叠中≥3个连续未配对核苷酸。

2.4.5 靶点可及性能量排序

通过ΔG_open=ΔG_free-ΔG_unpaired公式计算位点解链能，最终以ΔΔG=ΔG_duplex-ΔG_open量化结合效率。

3 Results

3.1 靶点鉴定

从200个miRNA中鉴定出159个靶向PB2的386个位点，其中30个位点具有功能性种子互补（表1）。如gga-miR-29a-5p在2253nt处形成17.2 kcal/mol高稳定性8mer杂交体（AGACAGCG/AGACTTGT）。

3.2 保守性验证

18个靶位点在跨洲毒株中高度保守（图3），如gga-miR-16c-5p靶向的1837nt位点（MFE=-15.63 kcal/mol）在所有亚洲分离株中完全保守。

3.4 靶位点可及性

全局折叠显示gga-miR-1744-5p在1866nt处形成突出环结构（图5e），区域折叠证实其103-111nt区段持续未配对（图6e），ΔΔG=-9.2 kcal/mol提示高效结合。

4 Discussion

研究首次揭示鸡gga-miR-1718等miRNA通过CDS区多靶点协同作用抑制PB2表达：

1. 1.

   机制创新性：不同于经典3'UTR调控，PB2 CDS区结合可能引发核糖体停滞导致mRNA降解；

2. 2.

   应用潜力：gga-miR-29a-5p在人类细胞中已证实可降低流感病毒载量，其鸡同源分子或可开发为跨物种抗病毒剂；

3. 3.

   风险考量：需通过Off-TargetFinder评估gga-miR-17-3p对宿主Bcl-2等凋亡基因的潜在脱靶效应。

5 Conclusion

该研究为利用宿主miRNA调控网络设计H5N1抗病毒策略奠定理论基础，未来需通过类器官模型验证gga-miR-1718等分子对病毒复制的抑制效果，并探索miRNA鸡尾酒疗法的协同效应。