缺氧条件培养的细胞外囊泡（EVs）联合生物正交水凝胶递送系统：创伤性脑损伤的多靶点再生治疗新策略

这篇研究开创性地开发了一种基于缺氧预处理的hiPSC-NPCs来源细胞外囊泡（EVs）与明胶基生物正交水凝胶（BIOGEL）的联合递送系统。通过模拟缺血微环境富集miRNA-9/VEGF等神经再生因子，结合仿生水凝胶的缓释特性，在动物模型中显著改善创伤性脑损伤（TBI）后的神经发生、髓鞘修复和血管重建，为神经再生医学提供了多靶点协同治疗新范式。

　　

1 引言

创伤性脑损伤（TBI）的继发性损伤涉及神经炎症、血脑屏障（BBB）破坏和神经再生障碍等多重病理过程。当前临床缺乏同时靶向这些通路的有效疗法。人类诱导多能干细胞来源的神经祖细胞（hiPSC-NPCs）在缺氧条件下分泌的细胞外囊泡（EVs）富含神经营养因子，但存在体内递送效率低的问题。本研究创新性地将缺氧预处理的EVs与具有脑组织仿生力学特性的明胶-降冰片烯/四嗪水凝胶（BIOGEL）结合，构建了兼具结构支撑与活性因子缓释功能的治疗平台。

2 结果

2.1 神经再生EVs-BIOGEL系统的开发

通过纳米粒子追踪分析（NTA）证实分离的EVs粒径为100-250 nm，携带CD81和缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）标志物。BIOGEL的剪切模量（≈1 kPa）与脑组织匹配，能在6天内持续释放EVs（图2d）。体外实验显示，该支架促进β-III微管蛋白（TUJ1）阳性神经元迁移，其3 cP的低剪切粘度支持微创注射。

2.2 缺氧预处理EVs的工程化优化

使用去铁胺（DFO）模拟缺氧环境，使hiPSC-NPCs分泌的EVs中miRNA-9表达量提升9.3倍（R²=0.9363），血管内皮生长因子（VEGF-A）增加4.5倍（图3c-d）。代谢组学分析显示，EVs内抗炎代谢物dynorphin和支链氨基酸降解通路显著富集（p<0.01），这些分子通过κ阿片受体和TCAC循环促进神经前体细胞分化。

2.3 多模态治疗载体促进神经元分化

缺氧EVs处理14天后，hiPSC-NPCs的成熟神经元标志物微管相关蛋白2（MAP2）表达量较对照组提高3.2倍（p<0.0124），突触素1（Syn1）阳性区域扩大2.8倍，证实其促进突触重建的能力（图3g）。

2.4 TBI模型中的病灶体积缩减

在大鼠控制性皮质撞击（CCI）模型中，DFO-EVs+BIOGEL治疗组皮层损伤体积降至2.62%（对照组4.35%），改良神经功能缺损评分（mNSS）从8.77降至4.53（p<0.0001）。转棒测试显示运动功能恢复至接近假手术组水平（152.125±104.997秒）（图4f-h）。

2.5 神经炎症调控与ECM重塑

治疗组小胶质细胞标志物Iba1⁺细胞减少70%，同时M2型巨噬细胞标记物CD163⁺增加3.6倍（图5d-e）。硫酸软骨素蛋白多糖（CS56）沉积降低67%，而神经营养因子p75NTR和脑源性神经营养因子（BDNF）分别提升2.1倍和3.5倍（p<0.001），创造了促再生微环境。

2.6 神经发生与髓鞘再生

海马齿状回（DG）区域SOX2⁺神经前体细胞增加6倍，髓鞘碱性蛋白（MBP）覆盖面积提升8倍（p<0.0001）。高分辨率成像显示新生神经元（NeuN⁺）与少突胶质细胞（SOX10⁺）形成紧密共定位（图6d）。

2.7 血管新生与BBB修复

CD31⁺内皮细胞密度增加4.1倍，紧密连接蛋白occludin表达提升2.7倍（p<0.01），证实该系统通过VEGF旁分泌作用重建脑血管网络（图S12）。

3 结论

该研究构建了首个整合缺氧预处理EVs与仿生水凝胶的模块化治疗平台，通过miRNA-9/VEGF轴向调控神经发生、血管生成和免疫微环境三重机制。BIOGEL的缓释特性使EVs在损伤部位滞留时间延长3倍，其力学特性抑制胶质瘢痕形成。这种"结构性支撑-功能性修复"协同策略为TBI临床转化提供了新思路。