DLK1在GnRH神经元发育中的双重作用：时间依赖性调控与中枢性性早熟机制解析

本研究针对Delta样非经典Notch配体1（DLK1）基因突变导致中枢性性早熟（CPP）的机制不明问题，通过CRISPR-Cas9构建DLK1缺失和激活的人多能干细胞（hPSCs）模型，首次揭示DLK1在GnRH神经元发育中的时序特异性调控作用：早期激活抑制前脑神经元分化，而后期激活促进GnRH1表达。该研究发表于《Stem Cell Reviews and Reports》，为理解 imprinting基因（印记基因）调控青春期启动提供了新视角。

　　

青春期启动的调控机制一直是内分泌领域的核心问题。中枢性性早熟（CPP）表现为青春期提前启动，目前已知少数遗传因素如MKRN3和DLK1基因突变可导致CPP，但DLK1作为paternally expressed imprinting gene（父源表达印记基因）的具体作用机制尚不明确。有趣的是，所有报道的DLK1突变均为功能缺失型，提示其可能作为"青春期刹车"，但这一假说缺乏直接实验证据。更复杂的是，DLK1属于DLK1-DIO3印记基因簇，该区域还包含非编码RNA MEG3等调控元件，在小鼠模型中已证实与神经发育相关。这些未解之谜促使Nazli Eskici团队开展这项研究。

研究人员采用三大关键技术：1）基于CRISPR-Cas9在H9 hESC系构建DLK1 exon 3缺失75bp的突变体（蛋白表达降低81%）；2）开发可诱导型CRISPRa系统（dCas9VP192+Tet-ON），实现DLK1在神经分化不同阶段的时序性激活；3）沿用已建立的hPSCs分化为GnRH神经元的三阶段方案（dual SMAD抑制→FGF8处理→Notch抑制），结合RNA测序和蛋白质组学分析。

DLK1 Protein Is Efficiently Depleted in the DLK1 Deletion Line

通过LC-MS/MS定量证实DLK1缺失株蛋白水平下降81%，但Western blot显示仍存在残余表达。该模型成功模拟了CPP患者的基因型特征。

Loss of DLK1 Protein Does not Accelerate GnRH Neuron Differentiation

意外发现DLK1缺失并未加速GnRH神经元分化（day25时GNRH1表达量与野生型无差异），提示CPP可能通过GnRH神经元上下游机制而非直接加速其发育导致。

DLK1 Has a Time-Dependent Effect on Neural Fate Determination

时序激活实验揭示DLK1的双重作用：在dSMADi阶段激活（acc）导致前脑标志物FOXG1/SOX2下调、Wnt通路基因（WNT1/RSPO2）上调，完全抑制GnRH神经元生成；而在FGF8阶段激活（cac）则使GNRH1表达增加2.5倍，ELISA检测到GnRH十肽分泌显著升高。

DLK1 Overexpression Alters the Transcriptomic Profile

RNA-seq显示早期DLK1激活引发全基因组重塑：①下调DLK1-DIO3基因簇（MEG3/DIO3）；②上调背侧脊髓中间神经元标志物（LMX1A/BHLHE22）；③Notch通路基因（HES1/HEY1）异常激活。这些变化共同导致腹侧神经元命运决定受阻。

这项研究首次系统阐释了DLK1在人类GnRH神经元发育中的时序特异性调控机制：早期通过抑制前脑神经前体形成"锁定"神经前体状态，后期则促进GnRH神经元成熟。这不仅解释了为何DLK1缺失突变导致CPP（可能通过解除对下游信号的抑制），还为理解印记基因簇在神经内分泌发育中的协同作用提供了新思路。值得注意的是，DLK1-DIO3基因簇的整体下调现象暗示该位点可能存在自我调控网络，这将是未来研究的重要方向。论文的创新性在于将干细胞模型、基因编辑和时序性激活技术相结合，为研究复杂发育疾病的分子机制建立了范式。