人重组凝聚素海马内注射可减少凝聚素敲除小鼠脑血管中β淀粉样蛋白聚集体的尺寸

这篇研究揭示了凝聚素(CLU)在阿尔茨海默病(AD)相关脑淀粉样血管病(CAA)中的关键作用。通过向Clu基因敲除小鼠海马内注射人重组Aβ（单独或与CLU联用），发现CLU能显著减小脑血管壁中Aβ聚集体的尺寸（p=0.02），但不改变血管内外总Aβ沉积量。该研究为理解CLU通过影响Aβ聚集状态来调节血管清除机制（IPAD）提供了新证据。

　　

ABSTRACT

研究团队通过基因关联分析发现，凝聚素(CLU)基因与阿尔茨海默病(AD)密切相关。CLU水平与大脑区域β淀粉样蛋白(Aβ)沉积呈正相关，尤其在脑淀粉样血管病(CAA)患者的动脉中表现显著。CLU能改变Aβ的聚集状态、毒性及血脑屏障(BBB)转运，提示其在调节大脑和脑血管中Aβ沉积与清除平衡中起关键作用。然而，CLU对Aβ沉积的作用是保护性还是致病性仍不明确。本研究旨在阐明CLU如何影响海马脑血管中Aβ沉积模式。

Methods

研究在6周龄Clu基因敲除小鼠（C57Bl6/J背景）中进行，分为两组：一组接受荧光标记的人重组Aβ海马内注射，另一组接受Aβ与CLU联合注射。10分钟后处死小鼠，通过共聚焦显微镜评估脑小动脉和毛细血管中Aβ沉积及其聚集体尺寸。

Results

结果显示，CLU显著减小了脑小动脉壁中Aβ沉积物的尺寸（p=0.02），但对动脉外组织的Aβ沉积尺寸无显著影响。在总体Aβ沉积量方面，Aβ+CLU组与单独Aβ组在脑小动脉和毛细血管中无显著差异。

Conclusions

研究证实CLU直接影响脑血管Aβ聚集状态。这一发现对CAA具有重要意义，因为CAA是脑出血和认知衰退的主要原因，尤其在AD患者中。CLU可能通过其分子伴侣功能抑制Aβ寡聚化，促进可溶性Aβ沿血管周围清除途径（IPAD）的有效排出。

1 Introduction

AD是最常见的年龄相关性痴呆类型，其神经病理学的关键特征是Aβ在脑血管壁沉积形成CAA。Aβ清除失败是AD和CAA发病机制的核心环节。主要清除途径包括沿脑血管平滑肌细胞基底膜的壁内动脉周围引流(IPAD)途径。衰老、APOE4基因型、Aβ免疫和高脂饮食都会改变IPAD途径结构。除IPAD外，Aβ还通过低密度脂蛋白受体相关蛋白1(LRP1)和类淋巴系统清除。

CLU（载脂蛋白J/ApoJ）是一种二硫键连接的异二聚体糖蛋白。全基因组关联研究显示，CLU基因常见变异与散发性AD显著相关。神经病理学研究显示，CLU与散发性CAA中的Aβ共同沉积。CLU可能通过与Aβ40寡聚体形成稳定复合物来影响Aβ聚集状态。

先前研究表明，当APP/PS1小鼠分别培育在Clu^+/+或Clu^-/-背景下时，Clu^+/+小鼠主要表现为脑实质斑块，而Clu^-/-小鼠则以脑血管CAA形式沉积Aβ。这提示CLU对Aβ沿脑血管的有效清除至关重要。本研究假设在Clu敲除小鼠中给予人重组CLU将显著减少Aβ在IPAD系统中的积累并改变其分布模式。

2 Materials and Methods

2.1 Animals and Procedures

实验在罗马尼亚Targu Mures大学进行，使用6周龄Clu^-/-小鼠（C57Bl6/J背景）。通过立体定位仪向海马注射荧光标记的人重组Aβ（单独或与CLU联用）。注射后10分钟灌注取脑，制作20μm厚冠状切片。

2.2 Immunofluorescence and Confocal Imaging

脑切片用抗胶原IV（标记血管基底膜）和α-SMA-FITC（标记血管平滑肌细胞）抗体染色，AlexaFluor 633二抗标记，共聚焦显微镜成像。

2.3 Image Processing

使用ImageJ分析软件，通过特定算法识别小动脉（胶原IV和α-SMA双阳性，面积>48.3μm²）和毛细血管（仅胶原IV阳性，面积>9.6μm²）。Aβ沉积通过白顶帽、墨西哥帽滤波和强度阈值法检测。

2.4 Data Visualisation and Statistical Analysis

采用广义线性混合效应模型(GLMM)分析数据。对于血管覆盖率，使用零膨胀β分布；对于聚集体尺寸，使用Tweedie分布。

3 Results

3.1 CLU Injection Had No Effect on Vascular Aβ Deposition

CLU注射对脑小动脉（对照组中位数3.38% vs CLU组2.03%）和毛细血管中Aβ覆盖率无显著影响（p>0.05）。

3.2 CLU Injection Decreased Aβ Aggregate Size Within the Walls of Arterioles

CLU显著减小小动脉壁内Aβ聚集体尺寸（p=0.02），中位数从8像素降至7像素。但对动脉外组织Aβ聚集体尺寸（中位数均为2像素）无显著影响。

4 Discussion

研究表明CLU能减小脑血管壁中Aβ聚集体尺寸，但不改变总沉积量。这与先前发现静脉注射CLU降低APP23小鼠CAA动脉数量的结果一致。CLU可能通过两种机制发挥作用：一是作为分子伴侣抑制Aβ寡聚化，促进可溶性Aβ沿IPAD途径清除；二是通过LRP2介导的BBB转运将Aβ-CLU复合物转移至循环系统。

值得注意的是，CLU对血管外Aβ聚集体尺寸无影响，可能因为其与血管基底膜和周细胞的相互作用对发挥伴侣功能至关重要。此外，血管Aβ沉积主要为Aβ40，而实质斑块多为Aβ42，这也可能影响沉积模式。

5 Conclusion

研究证实CLU通过调节Aβ聚集状态影响其沿脑血管的清除。在AD中，CLU可能通过稳定脑实质斑块或促进血管清除来预防CAA。由于斑块大小与认知衰退无关，而CAA是AD的关键病理特征，这些发现为开发针对CAA的新疗法提供了重要线索。