槟榔黄化病关键病原Areca palm velarivirus 1（APV1）衣壳蛋白互作位点鉴定及其致病机制研究

本研究针对槟榔黄化病主要病原Areca palm velarivirus 1（APV1）的致病机制展开攻关，通过酵母双杂交（Y2H）和双分子荧光互补（BiFC）技术首次揭示APV1衣壳蛋白（CP）与次要衣壳蛋白（CPm）的互作关系，鉴定出关键结合位点211RR212；利用马铃薯X病毒（PVX）异源表达系统证实CP是诱导烟草萎黄症状的致病因子，其双突变体CPR211A-R212A显著减弱致病性，为靶向病毒蛋白互作的防控策略提供理论依据。

　　

槟榔作为海南重要的经济作物，其黄化病（Areca palm yellow leaf disease, APYLD）近年来造成严重经济损失。该病由槟榔丝状病毒1号（Areca palm velarivirus 1, APV1）引发，属于长线形病毒科（Closteroviridae）Velarivirus属成员。病毒通过双衣壳系统（CP和CPm）完成基因组包装，但二者互作机制及其在致病过程中的作用尚不明确。更棘手的是，目前缺乏有效防控手段，亟需从分子层面解析病毒致病机制。

为解决这一科学问题，Meng Rui等研究人员聚焦APV1结构蛋白CP与CPm的互作特性及其致病功能。通过酵母双杂交和双分子荧光互补实验，首次证实CP与CPm在细胞核和细胞质中均存在直接相互作用。AlphaFold3结构预测结合定点突变技术，锁定CP蛋白C端保守的²¹¹RR²¹²双精氨酸残基为关键互作位点——当这两个带正电荷的残基突变为丙氨酸（CP^R211A-R212A）后，蛋白互作完全消失。值得注意的是，该突变并不影响CP的亚细胞定位，说明功能丧失源于特异性结合能力而非定位异常。

研究团队进一步利用PVX异源表达系统揭示CP的致病功能。在烟草中表达野生型CP导致叶片严重萎黄和皱缩，而CP^R211A-R212A突变体仅诱发轻微症状。Western blot和RT-qPCR证实突变体仍能稳定表达，排除了蛋白稳定性影响的可能。这首次确立APV1 CP为关键致病因子，且其致病性依赖于²¹¹RR²¹²位点的完整性。

关键技术方法包括：从APV1感染槟榔叶片克隆CP/CPm基因；通过重叠延伸PCR构建CP^R211A-R212A突变体；采用酵母双杂交和双分子荧光互补验证蛋白互作；利用GV1300载体系统进行亚细胞定位；基于PVX载体构建重组病毒进行致病性分析；通过Western blot和RT-qPCR检测蛋白表达水平。

Verification of the interaction between APV1 CP and CPm proteins

酵母双杂交显示pGBKT7-CP与pGADT7-CPm共转化酵母在选择性培养基上形成蓝色菌落，而反向组合无生长，证实CP-CPm单向互作特性。BiFC实验在烟草细胞核和细胞质中均检测到黄色荧光信号，为互作提供体内证据。

Key amino acid residues in APV1 CP and its interaction with CPm protein

序列比对发现²¹¹RR²¹²在Velarivirus属中高度保守。Y2H和BiFC证实CP^R211A-R212A完全丧失与CPm结合能力。AlphaFold3预测该突变导致CP C端α螺旋构象改变，破坏结合界面。

Subcellular localization of APV1 CP, CPm, and CP^R211A-R212A proteins

GV1300载体表达显示CP、CPm及突变体均定位于细胞核和细胞质，表明²¹¹RR²¹²突变不影响蛋白定位。

Pathogenicity of APV1 CP protein and its detection

PVX-CP侵染烟草7天后出现系统性萎黄，15天时症状加剧；而PVX-CP^R211A-R212A仅诱发轻微花叶。RT-qPCR显示两者转录水平无显著差异，证实症状差异源于CP功能而非表达量。

该研究首次阐明APV1 CP通过²¹¹RR²¹²位点与CPm互作，并鉴定CP为致病决定因子。这不仅为理解Closteroviridae病毒衣壳组装机制提供新视角，更揭示了一个可靶向的致病关键位点。未来可基于此开发干扰蛋白互作的抗病毒策略，为槟榔黄化病的绿色防控提供分子靶标。论文发表于《Phytopathology Research》，为热带作物病毒病害研究树立了范式。