FeDSNP-Pa纳米组装体：靶向氧化应激、炎症与细胞焦亡的三重作用策略用于青光眼视网膜神经节细胞保护

本研究发现FeDSNP-Pa纳米组装体通过三重协同机制实现对青光眼视网膜神经节细胞的显著保护：作为聚合物酶模拟物（PEM）催化清除活性氧（ROS），上调超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）表达；抑制TNF-α/NF-κB炎症通路；通过释放丙酮酸钠（Pa）阻断NLRP3/Caspase-1/GSDMD焦亡通路。该研究为青光眼治疗提供了新型纳米治疗策略。

　　

引言

青光眼是全球致盲的主要原因，其特征是视网膜神经节细胞（RGC）的进行性死亡。尽管眼压升高是主要病因，但临床研究发现即使控制眼压，RGC死亡仍会持续。研究表明氧化应激、炎症反应和内质网应激等多种机制参与RGC死亡，其中细胞焦亡（pyroptosis）作为新发现的程序性细胞死亡方式，在RGC死亡中发挥关键作用。

活性氧（ROS）包括过氧化氢、超氧阴离子和羟基自由基等，过量ROS会损伤细胞脂质、蛋白质和DNA，导致细胞功能障碍或死亡。ROS可通过氧化细胞膜不饱和脂肪酸、损害线粒体功能以及促进NLRP3炎症小体组装等多种途径诱发焦亡。因此，开发能够消除ROS、抑制炎症和焦亡的联合治疗策略，对青光眼治疗具有重要意义。

FeDSNP-Pa的合成与表征

研究团队设计了一种负载丙酮酸钠（Pa）的金属化纳米聚合物（FeDSNP-Pa）。该体系采用星形聚合物^BrDSNP作为支架，通过开环易位聚合（ROMP）制备，随后经N-丁基咪唑季铵化，并通过离子键合引入氯铁酸盐离子和丙酮酸根离子。

透射电镜（TEM）和原子力显微镜（AFM）显示FeDSNP-Pa呈近似球形，平均直径约80纳米。动态光散射（DLS）测得其流体力学直径约为105纳米。EDS和X射线光电子能谱（XPS）证实了铁物种的成功负载，质谱检测到丙酮酸根离子（m/z = 89和111）。ICP-MS结果进一步表明DSNP能将铁携带入细胞内。

体外治疗效果评估

采用大鼠视网膜前体R28细胞的氧糖剥夺（OGD）模型模拟急性青光眼病理状态。CCK-8实验表明，FeDSNP-Pa在Pa浓度为0.1 μM、铁离子浓度为0.1 μg/mL时对R28^OGD细胞活力提升效果最显著。

JC-1染色检测线粒体膜电位（MMP）显示，FeDSNP-Pa处理使JC-1聚集体/单体比值提高约2.7倍，流式细胞术证实FeDSNP-Pa组JC-1单体比例（≈23.1%）最接近正常组（≈22.5%）。Calcein/PI活死染色显示FeDSNP-Pa组死细胞比例最低（≈12.7%）。Annexin V/PI凋亡检测表明FeDSNP-Pa使细胞凋亡率降至≈8.1%，显著低于其他干预组。

ROS清除能力

使用DCFH-DA探针检测细胞内ROS水平，共聚焦显微镜显示FeDSNP-Pa组绿色荧光强度仅为R28^OGD组的≈4.8%。Mitosox检测线粒体ROS表明FeDSNP-P组红色荧光强度为R28^OGD组的≈9.6%。DHE检测超氧阴离子显示FeDSNP-Pa组红色荧光强度为R28^OGD组的≈12.87%。流式细胞术结果与显微观察一致，证实FeDSNP-Pa具有卓越的ROS中和能力。

抗氧化与抗炎能力

免疫荧光显示OGD显著下调R28细胞中SOD1和CAT表达，而FeDSNP-Pa处理能显著上调这些抗氧化因子。q-PCR和Western blotting结果一致表明，FeDSNP-Pa干预使SOD1、SOD2和CAT的mRNA和蛋白表达水平最高。

炎症因子检测显示，FeDSNP-Pa显著降低p-NF-κB、MMP9和MMP13的荧光强度。q-PCR显示FeDSNP-Pa组TNF-α mRNA水平最低，ELISA结果与此一致。这表明FeDSNP-Pa通过协同作用实现抗氧化和抗炎双重效果。

抗焦亡作用

共聚焦显微镜显示FeDSNP-Pa使NLRP3表达水平降至R28^OGD组的8%，N-GSDMD表达降至12%。Cleaved Caspase-1表达在FeDSNP-Pa组最接近正常水平。q-PCR表明FeDSNP-Pa显著下调IL-6、NLRP3、GSDMD和Caspase-1的mRNA水平。

扫描电镜（SEM）观察发现R28^OGD细胞表面存在焦亡孔洞，而FeDSNP-Pa处理组未见此类结构。这些结果证实FeDSNP-Pa通过抑制NLRP3/Caspase-1/GSDMD信号通路有效抑制R28^OGD细胞焦亡。

体内RGC保护作用

建立小鼠缺血/再灌注（I/R）急性高眼压模型。H&E染色显示FeDSNP-Pa处理使RGC数量恢复至每视野约36个，接近对照组（39个）。视网膜平片RBPMS标记显示FeDSNP-Pa组RGC数量最多，与对照组无显著差异。TUNEL染色表明FeDSNP-Pa组凋亡细胞数量最少。

免疫荧光和Western blotting结果显示，FeDSNP-Pa显著上调CAT和SOD1表达，抑制N-GSDMD和Cleaved Caspase-1表达。这表明FeDSNP-Pa通过增强抗氧化酶表达和抑制焦亡相关蛋白保护视网膜RGC。

视觉功能保护

光学相干断层扫描（OCT）显示FeDSNP-Pa处理使视网膜神经节细胞复合体（GCC）厚度达到对照组的99%。闪光视觉诱发电位（FVEP）检测表明FeDSNP-Pa组N2波振幅（≈14.3 μV）显著高于其他干预组。闪光视网膜电图（FERG）显示FeDSNP-Pa组b波振幅最高（≈2.33 × 10² μV）。

视觉悬崖测试中，FeDSNP-Pa组仅2/15小鼠选择深侧。 looming视觉刺激测试中，FeDSNP-Pa组应答者数量达9只。这些行为学实验证实FeDSNP-Pa能有效保护青光眼小鼠的视觉功能。

RNA-seq分析

全基因组RNA测序显示，与未治疗的 mice^I/R视网膜相比，FeDSNP-Pa治疗组有192个基因上调和189个基因下调。GO-KEGG分析表明未治疗组在干扰素反应、免疫应答、TNF生物合成正调控等生物学过程更显著。

GSEA分析显示未治疗组在Chemokine信号通路、NF-κB信号通路、Ras信号通路、MAPK信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用、凋亡、TNF信号通路、p53信号通路和JAK-STAT信号通路显著富集。蛋白互作分析进一步验证了这些通路的变化。

结论

FeDSNP-Pa通过三重协同机制保护急性青光眼RGC：作为PEM清除ROS并上调SOD和CAT表达；抑制TNF-α/NF-κB炎症通路；通过释放Pa阻断NLRP3/Caspase-1/GSDMD焦亡通路。体内外实验证实FeDSNP-Pa不仅能保护RGC，还能有效保留视觉功能。RNA-seq分析从转录组水平揭示了FeDSNP-Pa抑制RGC死亡的分子机制。这种将金属化纳米聚合物与丙酮酸钠结合的神经保护策略具有广阔的临床应用前景。

实验方法

研究使用R28细胞建立OGD模型，通过CCK-8、JC-1染色、活死染色和流式细胞术评估细胞活力和凋亡。SEM观察细胞形态，多种荧光探针检测ROS水平。免疫荧光、q-PCR和Western blotting分析蛋白和基因表达。建立小鼠I/R模型，通过H&E染色、视网膜平片、TUNEL染色评估RGC保护。OCT、FVEP、FERG和视觉行为学测试评估视觉功能。RNA-seq进行转录组分析。统计学处理采用Student's t检验和方差分析。