Chryseobacterium joostei二萜合酶CjCS的机制解析：揭示chryseojoostenes A-E生物合成中的氢迁移与骨架重排

这篇研究深入解析了Chryseobacterium joostei来源的二萜合酶CjCS催化生成chryseojoostenes A-E（1-5）的复杂机制。通过同位素标记实验、密度泛函理论（DFT）计算和底物类似物转化，揭示了罕见的1,4-质子迁移（chryseojoostene E生物合成）与电子轰击质谱（EIMS）碎片化的关联性。位点定向突变（SDM）成功捕获了野生型酶难以积累的次要产物，为理解萜类骨架多样性提供了新范式。

　　

Graphical Abstract

研究团队通过多学科手段揭示了细菌二萜合酶CjCS催化生成chryseojoostenes A-E的独特机制。关键发现包括：同位素标记实验证实了1,2-氢迁移（C→E）和罕见的1,4-质子迁移（C→I），后者导致chryseojoostene E（5）中C3=C15双键的形成。密度泛函理论（DFT）计算显示，1,4-质子迁移能垒仅1.3 kcal mol^-1，而EIMS碎片离子m/z 216的形成涉及类似的1,5-氢迁移（能垒19.3 kcal mol^-1）。

Abstract

CjCS利用香叶基香叶基焦磷酸（GGPP）构建了五个新颖二萜骨架。通过AlphaFold2模型指导的21种位点突变体构建，M86A突变体产量提升至野生型的118%，并富集了野生型难以检测的衍生物4-8。特别值得注意的是，I188L突变体使chryseojoostene E（5）的产量显著提高，其生物合成涉及从中间体C经质子三明治结构D到I的转化路径。

Introduction

萜类合酶（TSs）广泛存在于生物界，但Chryseobacterium属的酶功能尚未充分探索。本研究选择的CjCS与已表征的wanjudiene合酶（27%同源性）和polytrichastrene合酶（26%同源性）亲缘较远，其NSE三联体（D238）和保守的Mg²⁺结合基序提示其催化活性。

Results and Discussion

产物鉴定：从GGPP出发分离得到主要产物1-3（chryseojoostenes A-C），其绝对构型通过立体选择性¹³C/²H标记确定。例如，(2-²H)GPP标记实验显示H14α被氘代，证实了10Re,14Re-环化。

突变体工程：M86A突变导致产物谱剧变，生成dolabellane型衍生物6-8。其中7的光学旋光（[α]_D²⁵ = +22.2）与海藻来源的对映体（[α]_D = +27.5）构型矛盾，暗示自然界存在两种立体化学系列。

计算化学：DFT揭示了关键中间体C的C-H???π相互作用驱动1,4-质子迁移。质子三明治结构D（无能垒形成）的发现为理解长程氢迁移提供了新视角。

底物改造：14,15-二氢-GGPP被转化为germacrene A类似物10/12（经Cope重排为11/13），而20-去甲基-GGPP则生成大环二萜14，其形成源于中间体C_a的环开裂。

Conclusion

该研究不仅阐明了CjCS复杂的氢迁移机制，还通过SDM和底物工程策略拓展了萜类结构多样性。特别值得注意的是，生物合成与EIMS碎片化的氢迁移具有相似性，为质谱解析萜类结构提供了新思路。研究还揭示了细菌与八放珊瑚（如Eleutherobia rubra）二萜产物的对映体关系，为萜类进化研究提供了线索。