大肠杆菌MnmA依赖[4Fe-4S]铁硫簇催化tRNA中U34位点C2硫修饰的时序机制研究

这篇研究揭示了大肠杆菌MnmA酶通过[4Fe-4S]铁硫簇依赖机制催化tRNAGlnUUG/LysUUU/GluUUC中U34位点C2硫修饰（thiolation）的分子机制，证实该修饰先于C5位氨基甲基化（mnm/cmnm），并阐明铁硫簇在DXXC+C型催化模体中的核心作用，为理解tRNA修饰缺陷相关疾病（如线粒体疾病和癌症）提供新视角。

　　

Highlight

硫修饰机制新发现：采用优化后的[4Fe-4S]铁硫簇重建方案（2-3小时短时孵育替代过夜反应），我们成功获得具有特征性410 nm吸收峰的holo-EcMnmA蛋白（图2A）。值得注意的是，蛋白降解和铁硫簇不稳定性问题仍存在，这提示需要开发更稳定的制备工艺。

材料与方法

通过pET28a载体系统表达带His标签的野生型EcMnmA及其D99C突变体（将催化模体DXXC+C中的天冬氨酸突变为半胱氨酸），使用Horizon公司合成的tRNA^Glu转录本作为底物。ΔmnmA菌株的构建详见前期工作[16]。

讨论

争议性机制的澄清：使用无机硫化物直接验证了[4Fe-4S]铁硫簇对U34-tRNA C2位硫修饰的不可或缺性（图1C）。关键发现包括：1）已携带C5氨基甲基化修饰的ΔmnmA tRNA失去反应活性，证明体内修饰存在C2→C5的严格时序；2）无还原剂时，IscS/半胱氨酸体系不能提供硫原子，揭示DTT可能通过还原过硫化物（persulfide）干扰天然反应路径；3）D99C突变体虽保持体外活性却丧失体内功能，暗示软金属配位环境对铁硫簇生理功能具有特殊调控作用。

结论

这项研究确立了D型MnmA酶的铁硫簇依赖性催化范式，破解了关于其催化机制的长年争议。发现硫修饰与氨基甲基化的严格时序关系为理解翻译调控网络提供了新维度，而铁硫簇配位化学的特殊性则为设计靶向tRNA修饰通路的小分子药物开辟了新思路。