冠状病毒非结构蛋白nsp7-11多蛋白加工动力学及其与nsp16复合的跨物种比较研究

本研究针对冠状病毒复制转录复合体(RTC)组装关键环节，通过建立基于天然质谱(native MS)的多重切割反应动力学分析方法，系统揭示了SARS-CoV-2、SARS-CoV、HCoV-229E和MERS-CoV四种人类冠状病毒nsp7-11多蛋白加工时序规律及结构调控机制，发现甲基转移酶nsp16可与未完全加工的中间体形成功能性复合物，为靶向病毒蛋白加工的广谱抗病毒设计提供了新视角。

　　

冠状病毒作为引发从普通感冒到严重急性呼吸综合征等多种疾病的重要病原体，其复制过程依赖于病毒编码的非结构蛋白(nsps)形成的复制转录复合体(RTC)。这些nsps由病毒多蛋白pp1a/pp1ab经蛋白酶切割产生，其中主要蛋白酶Mpro(nsp5)负责加工nsp7-11区域。尽管多蛋白加工对病毒生命周期至关重要，但加工顺序如何调控、不同冠状病毒物种间是否存在保守机制、以及加工过程如何影响关键蛋白复合物组装等核心问题尚未阐明。

为回答这些问题，Kira Schamoni-Kast等研究团队在《Nature Communications》发表了创新性研究。研究人员建立了基于天然质谱的动力学分析方法，首次实现了对四种人类冠状病毒(SARS-CoV-2、SARS-CoV、HCoV-229E和MERS-CoV)nsp7-11多蛋白加工过程中所有四个切割位点(CS7/8、CS8/9、CS9/10和CS10/11)速率常数的同步测定，并结合AlphaFold3结构预测揭示了切割效率的结构基础。更重要的是，研究发现甲基转移酶nsp16不仅能与成熟nsp10结合，还可与未完全加工的中间体形成功能性复合物，这种灵活性可能对病毒逃逸宿主免疫监测具有重要意义。

关键技术方法包括：1)构建带SUMO-His6标签和天然末端的nsp7-11重组蛋白；2)开发"毛细管内连续反应"和"离散时间点采样"两种天然质谱策略，分别捕获快慢反应动力学；3)利用碰撞诱导解离验证蛋白复合物；4)基于Python脚本的定量分析流程提取速率常数；5)AlphaFold3预测蛋白结构域空间组织。

多蛋白加工动力学特征

研究发现四种冠状病毒表现出显著不同的加工模式：SARS-CoV和SARS-CoV-2优先切割CS10/11，而MERS-CoV独特地首先高效切割CS8/9。尽管CS7/8在所有物种中均含有保守的LQ序列，但其切割速率相差30倍，AlphaFold3预测该区域形成α螺旋结构可能是导致切割延迟的结构基础。值得注意的是，HCoV-229E和MERS-CoV的CS10/11切割效率明显低于SARS相关病毒，但该位点加工不完全仍允许功能性nsp16复合物形成。

加工与复合物组装的关联

通过分析nsp16与加工中间体的相互作用，发现即使保留nsp11的nsp10-11中间体也能与nsp16形成稳定复合物，而完全加工的nsp10则表现出更强结合力(KD=3.5μM)。特别引人注目的是，SARS-CoV-2的nsp16可与MERS-CoV的nsp10-11形成异源复合物，表明不同冠状病毒间存在保守的相互作用界面。

结构决定切割效率的机制

AlphaFold3预测显示，快速切割的CS8/9、CS9/10和CS10/11位于低置信度的无序区域，而缓慢切割的CS7/8被预测为α螺旋。这种结构特征与切割速率的高度相关性提示，局部二级结构重排可能是调控加工时序的关键因素。

这项研究的重要意义在于：1)建立了分析复杂多切割反应动力学的通用方法学框架；2)揭示了冠状病毒多蛋白加工既存在物种特异性特征又保留核心调控原则；3)证明功能性蛋白复合物可在加工完成前组装，拓展了对病毒复制机器动态组装的认识；4)为开发针对保守切割位点或复合物界面的广谱抗病毒药物提供了新靶点。研究结果特别指出，靶向CS7/8的α螺旋结构或nsp10-nsp16相互作用界面可能产生双重抑制效应，既能干扰加工时序又能破坏关键酶复合物功能，这种多靶点干预策略对应对快速变异的冠状病毒具有重要价值。