肽展示系统筛选出高效突变型β-黑素细胞刺激素作为黑皮质素4受体的强效激动剂

本研究针对GPCR（G蛋白偶联受体）与肽相互作用研究方法的局限性，开发了高通量细胞表面肽展示平台，结合β-arrestin（β-抑制蛋白）报告系统，对2,000余种β-MSH（β-黑素细胞刺激素）突变体进行筛选。发现关键残基D5H突变可显著增强MC4R（黑皮质素4受体）激活能力，为肥胖等代谢疾病的治疗提供新策略。

　　

在生命科学领域，G蛋白偶联受体（GPCR）作为最大的膜蛋白家族，调控着从感官知觉到能量代谢等关键生理过程。其中，黑皮质素4受体（MC4R）因其在能量平衡和食欲调控中的核心作用，成为对抗肥胖的重要靶点。然而，传统研究GPCR与肽相互作用的方法如噬菌体展示技术存在功能验证繁琐、通量低等瓶颈，而化学合成肽库的成本又令人望而却步。这些限制严重阻碍了针对MC4R等肽激活型GPCR的药物开发进程。

斯坦福大学的研究团队在《Cell Genomics》发表的这项研究，创新性地将高通量肽展示技术与β-arrestin报告系统相结合，建立了可直接关联肽变异与GPCR功能激活的筛选平台。通过深度突变扫描技术，研究人员系统解析了β-MSH肽每个氨基酸残基对MC4R激活的影响，不仅揭示了影响肽前体加工的关键位点，更发现了一个能显著增强受体活性的D5H突变体，为开发新型抗肥胖药物提供了分子蓝图。

关键技术方法包括：1）构建整合PDGFRβ跨膜结构域的细胞表面肽展示系统；2）采用改造的PRESTO-Tango报告系统（将tTA替换为tTA Advance，VP16替换为NFZ三部分激活剂）；3）设计包含2,500个元素的β-MSH突变库（含418个单点突变×5种密码子变体）；4）通过流式分选和深度测序分析荧光素酶表达差异；5）利用AlphaFold 3进行肽-受体共折叠预测。

研究结果

肽展示平台的设计与验证

通过将信号肽、目标肽段、MYC标签与PDGFRβ跨膜结构域融合，成功实现β-MSH在细胞膜表面的定位（>90%转导效率）。当与改造的MC4R-Tango报告系统（含TEV蛋白酶切割位点和TetR-NFZ激活剂）共表达时，展示的β-MSH可诱导相当于1μM合成肽的荧光素酶活性（p<0.0001）。比较不同连接肽（linker）发现，XTEN linker使细胞表面β-MSH丰度提高2倍，受体激活增强3倍，而过度柔性的(GS)_n linker则显著降低效果。

β-MSH深度突变扫描

在筛选的2,000余个突变体中，N端前四个残基（尤其E2G）的突变普遍导致功能丧失，这与临床肥胖儿童中E2G突变的高发生率相吻合。结构预测表明这些位点参与前体蛋白水解加工，而非直接受体结合——截去N端四肽的β-MSH仍保持完整活性。相反，第5-6位残基（如D5H）的突变可增强活性：D5H突变体使MC4R激活提升50%，其EC₅₀（1.46 nM）显著优于野生型（8.23 nM）。

结构机制解析

AlphaFold 3预测显示，D5H突变位于MC4R结合界面之外，其功能增益可能源于电荷反转（天冬氨酸[D]→组氨酸[H]）形成的稳定离子相互作用，而非构象改变。这与冷冻电镜解析的NDP-α-MSH-MC4R复合物结构一致，均显示HFRW基序是结合核心。

这项研究的意义在于建立了首个能在单细胞水平同时评估数千种肽变异GPCR激活效应的技术平台。发现的D5H突变体不仅为开发抗肥胖药物提供了先导化合物，其"功能获得"特性更提示可通过理性设计优化天然肽激素的疗效。该平台可扩展至其他肽-GPCR系统的研究，为靶向这类"难成药"受体的药物发现开辟了新途径。正如作者在讨论中指出，该方法克服了传统结合实验与功能验证脱节的瓶颈，将加速从基因变异到功能机制的转化研究进程。