多模态图像分析在IMMUcan大型癌症组织研究中的应用：标准化工作流程与跨技术一致性验证

为解决肿瘤微环境(TME)大规模空间解析的挑战，Eling和Dorier等开发了多重免疫荧光(mIF)和成像质谱流式(IMC)标准化工作流程，在泛欧IMMUcan联盟中完成10,000个样本分析。研究证实跨技术细胞类型检测高度一致，并发布开源工具IFQuant及标注数据集，为肿瘤免疫景观研究提供重要方法学支持。

　　

肿瘤微环境(TME)的异质性和空间组织特征是影响癌症进展和治疗响应的关键因素。尽管免疫检查点抑制剂等免疫疗法已取得突破，但仍有大量患者出现原发性或获得性耐药。这凸显了深入解析TME中免疫细胞与肿瘤细胞空间互作关系的迫切需求。传统研究多采用小样本队列或组织微阵列(TMA)，而像泛欧IMMUcan联盟这样对2,500例患者进行多组学整合分析的大规模研究仍属空白。

研究团队在《Cell Reports Methods》发表的工作，针对多重免疫荧光(mIF)和成像质谱流式(IMC)两种互补技术，建立了可处理数千样本的标准化流程。通过6年时间分析5种癌症类型（乳腺癌、肾细胞癌等）的10,000个样本，解决了大规模空间组学研究中的关键技术瓶颈：包括mIF全切片分析的自动化工具缺失、IMC区域选择的主观性、跨批次数据可比性以及细胞分型的标准化等问题。

关键技术方法包括：1) 开发IFQuant开源软件实现mIF图像解混、细胞分割和表型注释的自动化；2) 使用冻存抗体混合液控制IMC批次效应；3) 创新性IF/IMC共染色技术指导区域选择；4) 基于179例患者34万细胞的手动标注数据集，建立随机森林细胞分类器；5) 开发napari插件实现多模态图像对齐。样本来源于EORTC-SPECTA协议(NCT02834884)收集的FFPE组织。

mIF分析流程优化方面，通过6-plex抗体组合(CD3/CD11c/CD15/CD20/CD163/CK)的自动化染色和Phenolmager HT扫描，IFQuant软件实现了10-15分钟/样本的高通量分析。与DeepCell、Cellpose等工具对比显示，IFQuant在核分割性能上达到同类最优水平，同时具备独特的肿瘤-基质自动分区和三级淋巴结构(TLS)检测功能。

IMC流程创新体现在：1) 单批次可处理500样本的抗体混合液使细胞类型比例变异系数控制在15-25%；2) 机械臂自动加载系统使通量提升至40样本/批次；3) 基于手动标注数据训练的随机森林分类器在14种主要细胞类型的识别上显著优于Astir、Celesta等新兴算法(MacroF1提升20%)。

跨技术验证揭示：在7种匹配细胞类型中，B细胞(R²=0.92)和T细胞(R²=0.85)的丰度相关性最高，而中性粒细胞(CD15⁺MPO⁺ vs CD15⁺)因标记策略差异显示出较低一致性。空间分析通过L函数证实B细胞簇和肿瘤-基质界面在两种技术中的分布高度相似(p<0.01)。

该研究建立了目前最完整的癌症空间组学分析体系，其方法论创新具有三重意义：1) IFQuant填补了商业软件在LIMS系统集成方面的空白；2) 发布的34万细胞标注数据集为算法开发提供金标准；3) 证实mIF与IMC数据的可整合性，为后续发现TME生物标志物奠定基础。研究者特别指出，随着XTi等新一代IMC仪器的问世，基于低分辨率预览扫描的自动化区域选择将成为下一步优化方向。