纳米孔直接RNA测序技术nanoSundial助力大肠杆菌RNA修饰图谱的高精度解析

（编辑推荐）本研究通过优化纳米孔直接RNA测序（DRS）技术，开发了新型比较分析工具nanoSundial，系统评估了Dorado模型在细菌RNA修饰检测中的局限性，首次实现了大肠杆菌rRNA、tRNA和mRNA修饰位点的全转录组规模鉴定，为原核生物表观转录组学研究提供了方法学突破。

　　

技术革新：RNA004测序平台性能突破

最新发布的SQK-RNA004试剂盒配合FLO-MIN004RA流动槽展现出显著优势：单次运行可产生超过800万条读长，较前代RNA002提升4倍通量；中位质量值（Q score）达17.93-19.17，显著优于RNA002的13分。通过严格的尺寸选择和核糖体RNA去除（ss&rd）流程，成功获得52.3%的编码序列（CDS）覆盖度，为后续修饰分析奠定基础。值得注意的是，体外转录（IVT）样本与野生型（WT）的基因表达相关性高达0.95，但非编码RNA（如ssrA）在IVT中异常富集，提示需警惕逆转录偏好性对结果的影响。

模型评估：Dorado修饰检测的局限性

研究团队系统测试了Dorado v5.1.0的四种修饰模型（m⁶A、Ψ、m⁵C、A-to-I），发现存在显著假阳性问题。以Ψ模型为例，92.4%的IVT样本位点与WT重叠，但仅40.7%位点的"修饰分数"符合预期。通过建立WT-IVT差异阈值（35%），在rRNA上成功验证10个已知Ψ位点，但意外检出5个未报道位点。特别值得注意的是，m⁶A模型在23S rRNA的A2448位点检测到强烈信号，而16S rRNA的A1518位点实际应为m^6,6A修饰，揭示模型特异性不足的问题。

工具开发：nanoSundial的创新设计

针对现有工具缺陷，研究者开发了基于电流特征比较的nanoSundial算法。该工具采用四步核心策略：

1. 1.

   通过f5c eventalign实现纳米孔信号精准映射

2. 2.

   提取均值、中位数、驻留时间和标准差四维特征

3. 3.

   采用多元方差分析（MANOVA）进行统计学检验

4. 4.

   设置绝对均值差>0.18、驻留时间差>1的严格阈值

   在36个已知rRNA修饰位点验证中，nanoSundial的ROC曲线下面积（AUC）达90.3%，显著优于单特征分析。特别优化了低覆盖度（50×）数据的处理策略，通过4碱基滑动窗口有效捕获修饰信号的邻近效应。

tRNA修饰图谱：高密度修饰的精准解析

RNA004数据在tRNA检测中展现独特优势：

• •

  中位覆盖度突破2000×，是RNA002的10倍

• •

  成功鉴定201个MODOMICS数据库记录的修饰位点（占比58%）

• •

  发现赖氨酸tRNA（lysW）的Ψ修饰呈现最强电流差异

• •

  区分缬氨酸tRNA（valV/valW）的密码子特异性修饰模式

  值得注意的是，tRNA在WT样本中的比对准确度（97.5%）显著低于IVT样本（98.4%），印证了其高密度修饰对信号的影响。

生物学发现：mRNA修饰的调控规律

通过双生物学重复验证，发现190个稳定修饰的CDS区域，呈现显著特征：

• •

  71个基因中55个位于操纵子首尾位置

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  修饰密集区富集在5'UTR和3'UTR附近（如tig、fkpA基因）

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  翻译相关通路显著富集（p<0.01）

  典型案例如rpsQ操纵子（含11个基因），其末端修饰可能与核糖体功能调控相关。研究还发现三个特殊基因（yggX、infC、secD）虽位于操纵子中部，但在高表达转录本（>85%）中仍呈现末端修饰特征。

应用前景与局限性

nanoSundial的诞生填补了原核生物RNA修饰检测工具的空白，其创新性体现在：

1. 1.

   摆脱对特定修饰类型的先验知识依赖

2. 2.

   兼容RNA004平台的高通量数据

3. 3.

   实现±4bp的高分辨率定位

   但研究也揭示当前技术瓶颈：IVT样本存在ncRNA扩增偏好，mRNA修饰检测重复率仅61%，提示部分修饰可能具有动态特性。这些发现为细菌表观转录调控研究开辟了新方向，也为感染性疾病治疗靶点开发提供了新思路。