综述：纳米孔直接RNA测序技术进展及其对生物学研究的影响

这篇综述系统阐述了纳米孔直接RNA测序（DRS）技术的突破性进展，该技术通过单分子全长测序实现转录本异构体捕获和表观转录组修饰（如m6A、m5C）的原位检测，在癌症、植物和病毒研究中揭示了新型转录本、可变剪接事件及RNA编辑机制，为mRNA疫苗质控和RNA数据存储提供了创新工具。

　　

RNA的类型与功能

RNA在细胞活动和疾病进程中扮演关键角色。信使RNA（mRNA）作为编码RNA传递遗传信息，而转运RNA（tRNA）和核糖体RNA（rRNA）则参与蛋白质组装。此外，环状RNA（circRNA）和长链非编码RNA（lncRNA）通过调控基因表达影响疾病发展，例如circRNA可作为竞争性内源RNA（ceRNA）吸附microRNA。

RNA的转录后修饰

RNA剪接是真核生物基因表达的核心环节，通过可变剪接产生多样化的蛋白质变体。化学修饰如m⁶A（N⁶-甲基腺苷）和假尿苷（Ψ）调控RNA稳定性、定位及翻译效率，这些修饰的异常与癌症和神经退行性疾病密切相关。

传统RNA测序技术的局限

定量PCR（qPCR）和微阵列技术受限于通量，而第二代测序（NGS）依赖cDNA转换，无法保留天然RNA修饰信息。纳米孔DRS技术的出现突破了这些瓶颈。

纳米孔DRS原理

牛津纳米孔技术（ONT）通过电流信号变化直接读取RNA序列，无需逆转录。当RNA分子穿过纳米孔时，其碱基特异性阻断电流形成特征信号，结合机器学习算法可同时解析序列和修饰。

mRNA文库制备优化

真核mRNA需保留5′端帽结构和3′端poly(A)尾以提升测序效率。近期开发的RNA 002/004试剂盒显著提高了文库构建成功率，尤其适用于低丰度转录本。

生物信息学工具进展

分析流程包括原始信号质量控制（如Nanopolish）、参考基因组比对（Minimap2）及修饰检测（如m⁶A识别工具EpiNano）。深度学习模型Dorado将单碱基准确率提升至95%以上。

新转录本与疾病研究

在牛脂肪细胞中鉴定出37,950个新转录本，而腹主动脉瘤（AAA）研究揭示了剪接因子SRSF2的异常表达与疾病进展相关。DRS还能精准识别无义介导的mRNA衰减（NMD）靶标，为肿瘤早诊提供分子标志物。

技术挑战与未来方向

当前DRS仍面临测序错误率（约5%）和样本需求量较高的问题。固态纳米孔和动态调控电压技术有望进一步提升分辨率。结合单细胞测序（scRNA-seq）和空间转录组，DRS将在多组学整合分析中发挥核心作用。

应用前景

从新冠病毒基因组实时监测到RNA疫苗poly(A)尾长度质控，DRS正推动基础研究向临床转化。随着成本降低和算法优化，该技术或将成为解析RNA调控网络的“终极显微镜”。