钟氏栎叶片外植体间接体细胞胚胎发生及植株再生的多阶段技术体系建立与应用

针对珍稀树种钟氏栎(Quercus chungii)无性繁殖效率低下的问题，研究人员通过多阶段激素调控策略（2,4-D+6-BA诱导→NAA+6-BA增殖→ABA成熟），首次建立其叶片外植体间接体细胞胚胎发生(SE)体系，获得51.1%愈伤组织诱导率和5.67%植株转化率，为栎属植物克隆林业发展提供关键技术支撑。

　　

钟氏栎(Quercus chungii)作为中国特有的珍贵用材树种，兼具优质木材价值和生态适应性，却因分布碎片化、过度采伐成为濒危物种。传统扦插繁殖效率不足32%，而体细胞胚胎发生(Somatic Embryogenesis, SE)技术能实现大规模克隆繁殖，但栎属植物存在胚胎诱导率低、植株转化困难等瓶颈。这项发表于《Industrial Crops and Products》的研究，首次建立了钟氏栎叶片外植体间接SE技术体系，通过多阶段激素调控破解了繁殖难题。

研究采用两年龄实生苗新生叶片为外植体，通过多阶段培养基设计：MS+2,4-D(1.0 mg·L^-1)+6-BA(1.0 mg·L^-1)诱导愈伤组织，PGR-free间歇培养后，采用NAA(0.25 mg·L^-1)+6-BA(0.25 mg·L^-1)维持增殖，最终通过6-BA(0.5 mg·L^-1)黑暗培养和ABA(0.1 mg·L^-1)光照成熟实现胚胎发育。组织学分析证实了从单细胞/多细胞起源的间接胚胎发生路径。

研究结果：

1. 1.

   愈伤组织诱导：2,4-D与6-BA协同作用最佳，诱导率达51.1%，形成Ⅰ级（具持续胚胎发生能力）愈伤组织。

2. 2.

   增殖优化：NAA(1.0 mg·L^-1)+6-BA(1.0 mg·L^-1)组合使增殖生物量达4.92 g，保持胚胎潜能。

3. 3.

   预成熟处理：去除NAA仅保留6-BA(0.5 mg·L^-1)时，84.67%愈伤组织形成原胚团(PEM)，而添加NAA则抑制胚胎分化。

4. 4.

   胚胎成熟：0.1 mg·L^-1 ABA使77%体胚正常发育，过高浓度(0.5 mg·L^-1)导致30%异常次生胚。

5. 5.

   植株再生：40 g·L^-1蔗糖+1.0 g·L^-1肌醇培养基实现5.67%转化率，但根端萌发(61%)显著高于芽端(12%)。

该研究创新性提出"多阶段PGRs递减"技术框架，阐明auxin-cytokinin动态平衡对胚胎发育的关键调控：诱导期需高浓度2,4-D启动细胞重编程，增殖期需NAA维持胚性，而预成熟期需撤除auxin以促进形态建成。尽管植株转化率仍需优化，该体系为栎属植物克隆繁殖提供了可推广的技术模板，对濒危树种保护和工业用材林建设具有重要实践意义。组织学证据显示，钟氏栎SE同时存在单细胞(外胚层起源)和多细胞(分生组织团起源)两种胚胎发生途径，为研究木本植物细胞全能性激活机制提供了新模型。