光动力疗法与凋亡相关基因FGFR1在膀胱癌中的预后价值及cGMP-PKG通路机制研究

本研究发现EMP1、FGFR1、PLPPR4、JUN和TNFRSF25五个光动力疗法（PDT）相关凋亡基因（ARGs）可作为膀胱癌（BLCA）的新型预后标志物。通过多组学分析结合实验验证，首次揭示FGFR1通过激活cGMP-PKG信号通路抑制T24细胞增殖、迁移和侵袭的分子机制，为BLCA的靶向治疗和PDT联合疗法提供了新策略。

　　

引言

膀胱癌（BLCA）作为具有高发病率和死亡率的恶性肿瘤，给患者家庭和社会带来巨大经济负担。吸烟、职业暴露和血吸虫感染是其主要危险因素。研究表明BLCA占男性所有癌症的5%-10%，其发病率显著高于女性。目前早期肿瘤检测仍不充分，现有治疗策略未能显著改善患者总生存率，因此探索BLCA肿瘤发生中的新型预后生物标志物至关重要。

光动力疗法（PDT）是一种利用光敏剂在光激活下产生活性氧簇从而诱导靶向细胞死亡的非侵入性创新疗法。PDT在临床患者中耐受性良好，已越来越多地用于包括膀胱癌在内的人类癌症治疗。凋亡通路是细胞中规律发生的基本生物学现象，在维持细胞和组织稳态中起关键作用。尽管学者们日益关注凋亡相关基因（ARGs）在各种人类肿瘤中的功能，但PDT相关基因（PDTRGs）-ARGs在BLCA中的预后价值仍不明确。

研究方法

本研究从TCGA数据库获取BLCA的mRNA表达谱、临床信息和生存信息作为训练集，从GEO数据库获取GSE13507数据集作为验证集。通过GeneCards数据库以"Photodynamic therapy"为关键词搜索PDTRGs，在MSigDB数据库以"Apoptosis"为关键词获取ARGs。使用limma包分析TCGA-BLCA数据集中肿瘤样本与正常样本之间的差异表达基因（DEGs），并通过加权基因共表达网络分析（WGCNA）筛选BLCA相关模块基因。

通过GO和KEGG功能富集分析揭示候选基因的潜在机制，利用STRING数据库获取蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络。采用单变量Cox回归分析和LASSO回归筛选预后生物标志物，通过Kaplan-Meier生存分析和ROC曲线评估标志物的预后价值和诊断性能。使用GSEA和GSVA算法进行富集分析，通过CIBERSORT评估免疫浸润细胞类型的比例。

实验部分收集54例BLCA患者的癌组织和癌旁组织样本，使用人BLCA细胞系T24、J82和正常尿路上皮细胞SV-HUC-1。通过qRT-PCR检测基因表达，CCK-8分析细胞增殖，Transwell实验检测细胞迁移和侵袭，Western Blotting检测蛋白表达。

研究结果

差异表达基因与候选基因筛选

在TCGA-BLCA数据集中共筛选出1630个DEGs，其中866个下调基因和764个上调基因。WGCNA分析确定最佳软阈值为7，将模块划分为26个模块，其中MEsteelblue模块与肿瘤组样本高度相关。DEGs与ARGs和PDTRGs分别取交集，获得35个DEGs-ARGs和61个DEGs-PDTRGs，最终筛选出21个交叉基因作为后续研究的候选基因。

功能富集分析

KEGG富集分析显示149条通路显著富集，TOP15通路可视化发现21个候选基因主要参与MAPK信号通路、乳腺癌、Epstein-Barr病毒感染和乙型肝炎通路。GO富集分析表明这些基因主要参与上皮细胞迁移（BP）、cAMP依赖性蛋白激酶（CC）和泛素蛋白连接酶结合（MF）过程。PPI网络分析显示17个基因间存在27个PPI关系。

预后生物标志物筛选与验证

单变量Cox回归分析鉴定出6个具有预后显著性的基因，LASSO回归最终确定EMP1、FGFR1、PLPPR4、JUN和TNFRSR25五个基因可作为预后生物标志物。生存分析显示这五个生物标志物在高/低表达组间存在显著生存差异。ROC曲线分析表明这些标志物在训练集和验证集中均具有良好的诊断价值。

机制探索与实验验证

GSEA分析显示FGFR1主要参与核糖体、肌细胞细胞骨架、氧化磷酸化、cGMP-PKG信号通路等途径。GSVA算法筛选出11个组间差异显著的免疫应答通路，其中干扰素受体通路在癌症组中上调，其余10条应答通路在癌症组中下调。

实验验证表明EMP1、FGFR1、PLPPR4和JUN在BLCA组织标本和细胞系中显著降低，而TNFRSF25呈现相反趋势。FGFR1过表达显著抑制T24细胞增殖、迁移和侵袭能力。Western Blotting检测发现FGFR1过表达组中PKG1和PKG2蛋白水平明显上调，而PKG抑制剂(D)-DT-2抑制了这种增加。功能回复实验证实PKG抑制剂可逆转FGFR1对T24细胞生物学功能的抑制作用。

免疫微环境分析

CIBERSORT分析显示静息肥大细胞、M1巨噬细胞、M0巨噬细胞、初始B细胞和静息NK细胞在不同组间表现出显著差异。相关性分析发现EMP1与静息CD4记忆T细胞呈明显正相关，与浆细胞呈负相关。FGFR1主要与细胞因子受体、TCR信号通路、抗菌剂等通路呈负相关。

讨论与结论

本研究通过多种生物信息学方法筛选出21个ARGs-PDTRGs候选基因，最终鉴定出五个与BLCA预后相关的ARGs-PDTRGs（EMP1、FGFR1、PLPPR4、JUN、TNFRSF25）。这些基因可能通过MAPK信号通路等途径参与BLCA的发生发展。

FGFR1在多种人类癌症中起关键作用，本研究首次阐明FGFR1通过激活cGMP-PKG信号通路抑制T24细胞生物学功能的分子机制。cGMP-PKG通路在前列腺癌、卵巢癌等恶性肿瘤中已有文献记载，但其在BLCA中的调控机制仍是一个新兴研究领域。

免疫微环境分析揭示了这些预后标志物与免疫细胞和通路的复杂相互作用，为BLCA的免疫治疗提供了新靶点。虽然本研究存在样本量有限等局限性，但为BLCA的临床诊断、治疗和预后提供了新的潜在靶点，为个性化治疗或靶向治疗奠定了基础。

综上所述，本研究成功筛选出五个重要的ARGs-PDTRGs作为BLCA预后生物标志物，并通过实验研究证实FGFR1通过激活cGMP-PKG通路抑制T24细胞的增殖、迁移和侵袭，为BLCA的靶向治疗提供了新的理论依据。