基于定量点印迹技术检测CD3表达构建套细胞淋巴瘤新型预后模型及其临床意义

本研究通过定量点印迹（QDB）技术精准量化肿瘤微环境（TME）中CD3+ T细胞浸润水平，首次将CD3表达整合至MCL国际预后指数（MIPI）模型中，构建出MIPI/CD3新型分层系统。该模型显著提升了对套细胞淋巴瘤（MCL）患者风险分层及预后预测的准确性，为MCL的个体化治疗提供了新的分子标志物和量化工具。

　　

背景

套细胞淋巴瘤（Mantle Cell Lymphoma, MCL）是一种罕见且侵袭性强的B细胞非霍奇金淋巴瘤亚型，中位发病年龄为65岁，患者总生存期（OS）通常仅为3至5年。其发生与t(11;14)染色体易位导致Cyclin D1过表达密切相关，该异常直接引起细胞周期调控紊乱，进而驱动MCL的发生发展。目前，MCL国际预后指数（MIPI）是国际公认的MCL风险分层工具，但其主要依赖年龄、乳酸脱氢酶（LDH）水平、临床分期和白细胞计数等临床参数，未能纳入可反映肿瘤生物学特性的分子标志物，因此在全面评估疾病复杂性和预测预后方面存在局限。探索有效的分子标志物对于MCL的预后评估和治疗策略制定具有重要意义。

近年来，肿瘤微环境（Tumor Microenvironment, TME）在淋巴瘤进展和预后中的作用日益受到关注。TME由肿瘤细胞、微血管、基质细胞及少量浸润的免疫细胞（如T淋巴细胞）共同构成。研究表明，CD3⁺ T细胞作为TME中的关键免疫成分，在多种实体瘤（如胃癌、结直肠癌、胶质母细胞瘤）中，其浸润程度与更好的预后显著相关。在MCL中，也有报道指出淋巴结及外周血中CD4⁺ T细胞数量及CD4/CD8比值与OS呈正相关。CD4⁺ T细胞通过直接分泌IFN-γ、TNF等细胞因子抑制肿瘤血管生成，并可激活CD8⁺ T细胞等免疫细胞间接增强抗肿瘤免疫应答。

然而，传统免疫组织化学（IHC）技术由于存在主观判读、半定量分析以及结果可变性高等局限性，难以实现CD3表达的精确量化。定量点印迹（Quantitative Dot Blot, QDB）是一种新兴的高通量蛋白质绝对定量技术，具备高精度、高重复性等优势，可克服IHC的不足。本研究旨在采用QDB和IHC两种方法量化MCL患者组织中CD3⁺ T细胞水平，评估其预后价值，并进一步将CD3量化数据与MIPI整合，构建新型MIPI/CD3预后模型，以提升MCL风险分层的准确性。

患者与方法

本研究回顾性收集了2008年1月1日至2020年9月8日期间于烟台毓璜顶医院、齐鲁医院、山东省立医院及西南医科大学附属医院病理科确诊的120例初治MCL患者的石蜡包埋（FFPE）组织标本及临床病理资料。所有诊断均经三名病理医师根据形态学及免疫组化结果共同确认。排除既往接受过治疗或诊断不明确的病例。通过定期随访患者或其亲属详细记录生存信息，总生存期（OS）定义为从确诊日至死亡或末次随访的时间。

实验主要试剂包括兔抗人CD3单克隆抗体（货号EP41）、HRP标记驴抗兔IgG二抗、BCA蛋白定量试剂盒及QDB检测板等。IHC染色采用链霉亲和素-生物素复合物法，以3,3’-二氨基联苯胺（DAB）为显色底物。由不知晓患者临床结局的三名病理医师随机选择10个400倍高倍视野手动计数CD3⁺ 细胞数，取平均值作为IHC评分。

对于QDB分析，取2张5 μm厚FFPE组织切片进行脱蜡、裂解，离心取上清，采用BCA法测定总蛋白浓度。每个样本取2 μL组织裂解液上样于QDB板，设3个复孔，室温干燥1小时后用5%脱脂牛奶封闭。加入1:1000稀释的抗CD3一抗4℃过夜孵育，随后加入二抗室温孵育4小时，最后加入ECL化学发光底物，用Tecan Infiniti 200 Pro酶标仪进行荧光信号采集。根据CD3标准品浓度曲线计算样本中CD3的绝对含量（单位：nmol/g）。实验有效性的标准为目标蛋白测量值与记录值偏差在±10%以内。

利用R软件（v4.3.3）中的“survminer”包确定CD3表达的最佳截断值，将患者分为CD3^low和CD3^high两组。根据标准计算每位患者的MIPI评分并进行风险分组：0–3分为低危，4–5分为中危，6–11分为高危。进一步将QDB测得的CD3水平与MIPI评分整合，构建MIPI/CD3模型：CD3水平低于截断值计1分，高于截断值计0分；MIPI评分低危、中危、高危分别计1、2、3分；累加得分1分为低危，2分为低-中危，3分为高-中危，4分为高危。采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，Log-rank检验比较组间差异，P < 0.05认为具有统计学意义。

结果

本研究共纳入120例初治MCL患者，其中男性87例，女性32例，男女比例约2.7:1，中位年龄63岁（范围：35–86岁）。71例患者具有完整随访资料，中位随访时间24个月（范围：0–96个月），至随访结束共42例死亡，总死亡率59.2%。

通过“surv_cutpoint”函数确定CD3 QDB法定量截断值为0.042 nmol/g，IHC法定量截断值为303.5 cells/hpf。根据QDB结果，CD3^high组患者OS显著优于CD3^low组（P = 0.0051）；而基于IHC手动计数的分组则未见统计学差异（P = 0.47）。MIPI模型将患者分为低危（7例）、中危（18例）和高危（22例）三组，其OS差异具有显著性（P = 0.048）；但MIPI-c模型区分风险能力有限（P = 0.08）。新构建的MIPI/CD3模型将患者分为4个风险组：低危（6例）、低-中危（17例）、高-中危（18例）和高危（6例），各组间OS差异最为显著（P = 0.0075），且在区分低危与高危患者方面表现出最优的准确性。

讨论

本研究通过高通量、高精度的QDB技术首次实现了MCL肿瘤微环境中CD3⁺ T细胞的绝对定量，并证实CD3^high是MCL的有利预后因素。这一发现与T细胞介导的抗肿瘤免疫机制相符：CD3⁺ T细胞通过识别肿瘤相关抗原、释放细胞因子（如IFN-γ）、直接杀伤肿瘤细胞以及形成免疫记忆等多重机制抑制肿瘤进展。近期研究还表明，CD3⁺ T细胞高浸润的MCL肿瘤区域中，CD8⁺ 细胞毒性T细胞高表达PRF1、GZMK等效应分子，肿瘤细胞则上调IL7R、CD80等基因，提示其具有更强的T细胞招募和免疫激活能力。

在方法学上，QDB显示出较IHC更优的重复性和准确性，避免了主观判读带来的变异性，为临床生物标志物的量化检测提供了新工具。此前该技术已成功应用于乳腺癌、胃癌、甲状腺癌等肿瘤的Cyclin D1、CD3等蛋白的定量分析。本研究进一步将CD3的QDB定量结果与MIPI整合，所构建的MIPI/CD3模型在预后预测中的表现显著优于单独使用MIPI或MIPI-c，证实了联合分子标志物与临床指标在提升淋巴瘤分层精度方面的巨大潜力。

本研究仍存在一定局限性：样本量较小，且仅有71例患者具备完整随访数据，可能影响统计效能并引入选择偏倚。此外，所有样本均来自国内少数中心，结论的外推性需进一步验证。未来需开展更大规模、多中心的前瞻性研究以验证MIPI/CD3模型的临床适用性，并推动QDB技术成为MCL生物标志物检测的标准工具之一。

结论

本研究证实通过QDB技术定量检测的CD3⁺ T细胞是MCL独立的预后生物标志物，其高表达提示更好的生存结局。基于QDB的CD3量化数据与MIPI整合而构建的MIPI/CD3模型，相比传统MIPI或MIPI-c具有更优的风险分层能力，为MCL患者的个体化预后评估提供了新依据。QDB作为一种精准、可靠的蛋白质定量方法，在临床转化应用方面具有广阔前景，但其实际效用仍需在大规模队列中进一步验证。