三种半合成策略构建不同硫酸化模式的硫酸化凝胶多糖及其免疫调节活性研究

本综述系统探讨了通过直接区域选择性硫酸化、选择性脱硫及多步保护-硫酸化-去保护三种互补性半合成策略，制备具有不同硫酸化程度（DS）和模式（DS-2, DS-4, DS-6）的硫酸化凝胶多糖（CS）衍生物。研究采用核磁共振（NMR）技术对产物结构进行精确表征，并筛选代表性衍生物进行免疫学评价（NO、TNF-α、IL-6、IL-10检测及TLR2/TLR4激活实验），揭示了硫酸化模式对巨噬细胞免疫调节活性的显著影响，为硫酸化多糖作为糖胺聚糖（GAGs）模拟物在免疫治疗中的应用提供了结构-活性关系依据。

　　

引言：凝胶多糖（Curdlan）是一种从细菌中提取的线性同多糖，由β-1→3连接的葡萄糖（Glc）单元组成。因其独特的流变学和热学特性，被广泛应用于食品工业。近年来，其在药物封装以及先天性和适应性免疫中的调控作用，激发了人们对凝胶多糖及其衍生物在生物医学应用中日益增长的兴趣。其中，硫酸化凝胶多糖衍生物不仅显著增强了天然凝胶多糖的水溶性，还在体外和体内实验中展现出高效的免疫调节潜力。硫酸化多糖作为工程化硫酸化多糖（ESPs）的代表，可通过化学、酶促或化学-酶促硫酸化天然非硫酸化多糖获得，以赋予后者新的和增强的生物特性。然而，ESPs通常通过随机硫酸化反应获得，无法控制硫酸基团在多糖重复单元内的区域选择性。近年来，研究人员致力于开发多糖区域选择性硫酸化的方法，主要原因是ESPs可作为糖胺聚糖（GAGs）的类似物在生物事件中发挥作用。GAGs是广泛存在于自然界尤其是哺乳动物（包括人类）中的硫酸化多糖，能够通过其硫酸化模式（即硫酸基团沿多糖骨架的分布）编码多种生物信息，因此在免疫、血管生成、癌症和传染病等众多生理病理过程中扮演关键角色。多糖化学硫酸化区域选择性安装硫酸基团的策略主要依赖三种方法：通过足够温和的条件控制区域选择性的直接反应硫酸化最活泼的羟基；对先前获得的过硫酸化多糖衍生物上最活泼的硫酸基团进行脱硫；基于在多糖的某些羟基上区域选择性安装合适的保护基团，然后硫酸化未保护位置，最后裂解先前安装的保护基团的多步方法。

材料与方法：本研究首先对天然凝胶多糖进行部分酸水解，使用1 M三氟乙酸（TFA）在60°C下处理3小时，通过透析纯化后获得低分子量凝胶多糖（LMW-C）。随后通过三种不同的半合成策略对LMW-C进行区域选择性硫酸化。第一种策略是直接硫酸化，测试了不同反应条件，包括溶剂（DMSO或DMF）、硫酸化试剂（SO₃·吡啶或SO₃·DMF）及其用量，以找到在Glc O-6位点进行区域选择性硫酸化的最佳条件。第二种策略是选择性脱硫，使用BTSA或MTSTFA作为脱硫剂，对过硫酸化LMW-C衍生物CS-6进行处理，旨在选择性切除O-6位的硫酸基团。第三种策略是多步保护-硫酸化-去保护方法，使用了三苯甲基（Tr）醚或苯甲酰（Bz）酯作为保护基。Tr保护基于其显著的空间位阻，用于保护Glc单元的伯醇基团；Bz保护则通过有机催化的位点选择性方法安装。所有获得的硫酸化衍生物均通过一维和二维核磁共振（NMR）技术，包括¹H NMR、¹³C NMR、DEPT-HSQC和COSY，进行详细的结构表征，以确定总硫酸化程度（DS）以及O-2、O-4和O-6位的硫酸化程度（DS-2、DS-4、DS-6）。表征后，从18种衍生物中筛选出6种代表性化合物（CS-1、CS-4、CS-10、CS-13、CS-17和CS-18），它们代表了不同的硫酸化程度和模式，用于后续的免疫学实验。免疫学评估使用野生型小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDM）系。检测指标包括一氧化氮（NO）产量（通过Griess反应测定亚硝酸盐水平）、细胞因子（TNF-α、IL-6和IL-10）水平（通过ELISA测定），并研究了这些产物对Toll样受体2和4（TLR2和TLR4）的激活作用（使用HEK-Blue? hTLR2和hTLR4报告细胞系）。此外，还使用了选择性抑制剂来探究信号通路，包括诱导型一氧化氮合酶（iNOS）抑制剂S-MIU、ERK1/2抑制剂U0126、JNK抑制剂SP600125和NF-κB抑制剂JSH23。

结果与讨论：通过直接硫酸化策略，在温和条件下（如SO₃·吡啶/DMSO，室温，75分钟）成功获得了主要在O-6位硫酸化的衍生物（如CS-1，DS-6 = 0.70），其¹H, ¹³C-DEPT-HSQC谱图显示仅在δ_H > 4.0 ppm处有CH₂编辑信号，表明硫酸化专一发生于伯醇位点。改变溶剂（如DMF）或增加硫酸化试剂当量则导致在O-2和O-4位出现副硫酸化，得到DS更高的衍生物（如CS-4, DS-2=0.34, DS-4=0.65, DS-6=1.00；CS-6为过硫酸化产物，DS=3.00）。通过选择性脱硫策略，使用BTSA对CS-6进行处理，成功实现了O-6位的完全脱硫，得到衍生物CS-9（DS-6=0），其骨架主要由2-O-硫酸化、2,4-二-O-硫酸化及未硫酸化的Glc单元构成（DS-2=0.67, DS-4=0.47）。而使用MTSTFA则得到部分脱硫的产物CS-8（DS-6=0.48, DS-2=0.34, DS-4=0.37），脱硫过程显示出一定的随机性。通过多步保护-硫酸化-去保护策略，使用Bz保护基的策略成功获得了仅在次级羟基（O-2和O-4）硫酸化的衍生物CS-10（DS-2=0.54, DS-4=0.42, DS-6=0），证明了该路线的有效性。而使用Tr保护基的策略则未能实现区域选择性，所得产物CS-11和CS-12的硫酸基团在O-2、O-4和O-6位随机分布。免疫学评价结果表明，未硫酸化的LMW-C（100 μg/mL）能显著刺激BMDM细胞产生NO（8.68 μM）、TNF-α和IL-6，此效应依赖于iNOS、ERK1/2、JNK和NF-κB信号通路的激活。然而，其硫酸化衍生物均未表现出类似的直接免疫刺激活性。在LPS诱导的炎症模型中，与LMW-C同时加入衍生物未显示抑制效果。但令人惊讶的是，预先用衍生物（CS-4, CS-10, CS-13, CS-17, CS-18；100 μg/mL）处理BMDM细胞5小时，再施加LPS刺激，则能显著抑制LPS诱导的NO产生，表现出剂量依赖性的保护（抗炎）效应，且此效应强于LMW-C本身。值得注意的是，仅在O-6位硫酸化的CS-1（DS=0.70）未显示出此保护活性，而主要在O-2位硫酸化的CS-18（DS=0.65）则效果显著，强烈暗示硫酸化模式（而不仅仅是总DS）是调控其免疫调节功能的关键结构特征。在细胞因子方面，LMW-C及CS-1、CS-18能直接诱导TNF-α和IL-6的产生，且此效应也经证实依赖于MAPK和NF-κB通路。在受体激活实验中，所有测试样品均能激活TLR2，且与LMW-C无显著差异。然而，对于TLR4的激活则出现分化，CS-1和CS-17未能激活TLR4，再次表明硫酸化模式的细微差异足以影响其与特定免疫受体的相互作用。

结论：本研究通过三种互补的半合成策略，成功制备并精细表征了一个结构多样（DS 0.34-3.00）、硫酸化模式（DS-2, DS-4, DS-6）覆盖广泛的硫酸化凝胶多糖（CS）衍生物库。初步的免疫学筛选揭示了硫酸化修饰，特别是硫酸基团在葡萄糖重复单元上的特定分布（硫酸化模式），而不仅仅是总硫酸化程度，对其免疫调节活性（尤其是巨噬细胞在炎症挑战下的预适应保护效应）具有至关重要的影响。这些发现为理性设计具有特定免疫干预功能的硫酸化多糖药物，尤其是作为GAGs模拟物，提供了宝贵的结构-活性关系基础，并为后续深入的机制研究（如与TLRs、Dectin-1等受体的详细相互作用研究）及治疗应用开发指明了方向。