甲基乙二醛（MGO）作为骨水泥抗菌添加剂防治假体周围关节感染的体外评价与机制研究

《Frontiers in Bioengineering and Biotechnology》：In vitro evaluation of methylglyoxal as an antibacterial additive to bone cement

本刊推荐：本研究系统评估了麦卢卡蜂蜜主要抗菌成分甲基乙二醛（MGO）作为聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）骨水泥添加剂的应用潜力。结果表明，MGO对假体周围关节感染（PJI）相关病原体伪中间葡萄球菌（S. pseudintermedius）具有显著抑制作用（MIC=0.15 mg/mL），能有效减少细菌对骨水泥表面的定植（25 mg/片）和宿主细胞感染（0.05 mg/mL）。虽然高浓度MGO（IC50=0.17 mg/mL）会通过激活p38 MAPK通路影响细胞活性，但其独特的抗菌机制和剂量依赖性效应为开发新型抗菌骨水泥提供了重要理论依据。

　　

1 引言

假体周围关节感染（PJI）是关节置换术后严重的并发症，也是人类和兽医领域中植入物失败的主要原因之一。随着全球抗生素耐药性的上升以及PJI防治措施的不足，寻找新型抗菌物质已成为当务之急。甲基乙二醛（MGO）作为一种二羰基化合物，被确认为麦卢卡蜂蜜中的主要抗菌成分。麦卢卡蜂蜜源自澳大利亚和新西兰特有的麦卢卡树（Leptospermum scoparium），因其抗菌特性已被广泛应用于伤口凝胶、微针贴片和涂层敷料等医疗领域。与其他医用蜂蜜通过蜜蜂防御素-1和过氧化氢（H₂O₂）发挥抗菌作用不同，麦卢卡蜂蜜的抗菌活性主要归因于MGO的存在。

MGO通过糖酵解过程中的二羟基丙酮形成，不仅能抑制多种病原体（如铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌）的生长，还表现出体外抗生物膜活性。其抗菌机制主要涉及与蛋白质、脂质和核酸结合形成高级糖基化终末产物（AGEs），从而导致这些大分子功能受损。在细菌中，MGO可结合菌毛和鞭毛蛋白，破坏其结构完整性和功能，限制细菌粘附和运动能力。此外，MGO还能与某些抗生素（如利奈唑胺、哌拉西林和阿米卡星）产生协同作用，增强抗菌效果。

全关节置换术是一种常见的关节破坏修复手术，但PJI仍是其主要并发症之一。在兽医领域，小动物的髋、膝和肘关节置换术后感染率高达2.6%–10%。假体周围关节感染的病原体包括强毒力和机会性致病菌。在人类中，常见的有金黄色葡萄球菌、肠球菌、链球菌和芽孢杆菌属；而在小动物中，超过50%的术后感染由金黄色葡萄球菌和伪中间葡萄球菌引起。伪中间葡萄球菌是一种凝固酶阳性的机会性病原体，主要定植于猫和狗，引起皮肤感染，同时也是一种人畜共患病原体，可感染免疫缺陷患者和与伴侣动物密切接触的人群。耐甲氧西林伪中间葡萄球菌（MRSP）的出现更增加了治疗难度，其常与多重耐药性相关。

聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）骨水泥广泛用于骨科治疗，主要用于固定关节植入物，也可用于骨折修复或寰枢椎不稳的椎体稳定。骨水泥还可作为抗生素局部给药的载体，直接在感染部位释放高浓度药物。目前常用的抗生素骨水泥（ALBCs）主要含有氨基糖苷类和氨基肽类抗生素。然而，ALBCs的有效性因证据有限而受到质疑，且低浓度抗生素的持续释放可能导致新的耐药性产生。因此，寻找既能有效对抗相关病原体又具有良好生物相容性的新型抗菌物质至关重要。

2 材料与方法

2.1 骨水泥制备

使用PALACOS? LV骨水泥（Heraeus Medical，德国），在无菌条件下混合后注入硅胶模具中，制成直径9 mm、高4 mm的圆形片剂。将MGO溶液（33.4 wt%水溶液；Thermo Fisher Scientific，美国）在混合前加入骨水泥的液体组分中。

2.2 细胞系与培养基

采用人骨肉瘤细胞系HOS（CRL-1543，ATCC，美国）进行细胞毒性、细菌粘附和内化实验以及Western blot样品制备。细胞在含10%胎牛血清（FBS）、1% L-谷氨酰胺、1%非必需氨基酸和1%青霉素/链霉素的EMEM培养基中培养，置于37°C、5% CO₂培养箱中。

2.3 细菌菌株

使用一株敏感（SP1）和两株多重耐药（RSP1和RSP2）伪中间葡萄球菌临床分离株。菌株来自犬只，经MALDI-TOF MS鉴定和药敏试验确认。细菌在哥伦比亚血琼脂上培养，实验中使用Mueller Hinton肉汤（MHB）培养。

2.4 抗菌活性测试

采用肉汤微量稀释法测定MGO对三种伪中间葡萄球菌分离株的最小抑菌浓度（MICs）。将MGO在MHB中稀释至0.025–0.78 mg/mL，与0.5麦氏浊度的菌液共同孵育18小时后观察细菌生长抑制情况。通过LIVE/DEAD? BacLight?细菌活力试剂盒染色和荧光显微镜观察细菌在含MGO骨水泥片上的生长情况。

2.5 MGO对细菌粘附和内化的影响

将HOS细胞与伪中间葡萄球菌SP1（MOI=10:1）共同孵育2或4小时，加入0.05 mg/mL MGO或培养基对照。通过庆大霉素处理杀死胞外细菌，裂解细胞后计数菌落形成单位（CFU）。

2.6 细胞活力与增殖测定

采用MTS法和结晶紫法分别检测HOS细胞活力和增殖。通过骨水泥浸提液处理细胞，分析其对细胞活性和细胞因子释放的影响。使用Live/Dead?活力/细胞毒性试剂盒染色并计数骨水泥表面细胞。

2.7 ELISA检测

采用DuoSet? ELISA试剂盒检测细胞上清液中白细胞介素-6（IL-6）和白细胞介素-1β（IL-1β）的浓度。

2.8 Western blot

提取经MGO或骨水泥浸提液处理的HOS细胞总蛋白，通过BCA法测定蛋白浓度。使用p38 MAPK和磷酸化p38（p-p38）抗体进行Western blot分析，检测p38通路激活情况。

2.9 统计分析

使用GraphPad Prism 10进行统计学分析，采用Kruskal-Wallis检验、Friedman检验或Mann-Whitney检验，p≤0.05认为有显著差异。

3 结果

3.1 抗菌活性

MGO对三种伪中间葡萄球菌分离株（SP1、RSP1和RSP2）的MIC均为0.15 mg/mL。在骨水泥中添加25 mg MGO/片能有效防止细菌在骨水泥表面附着和生长，而低剂量组（5 mg和10 mg）则无此效果。

3.2 对细菌粘附和内化的影响

0.05 mg/mL MGO能显著减少伪中间葡萄球菌对HOS细胞的粘附和内化，且作用随时间延长而增强。

3.3 细胞活力、增殖和细胞因子释放

MGO对HOS细胞活力的IC₅₀为0.17 mg/mL。增殖实验显示U型剂量反应曲线，0.05–1.5 mg/mL MGO处理组细胞增殖均低于对照组的70%。骨水泥浸提液实验表明，25 mg MGO/片的浸提液（1 mL和3 mL）显著降低细胞活力和增殖，但不引起IL-6和IL-1β释放增加。直接接种实验显示，25 mg MGO/片显著减少骨水泥表面活细胞数量和总细胞数。

3.4 p38 MAPK激活

0.15 mg/mL和0.25 mg/mL MGO处理显著增加HOS细胞中p-p38水平。25 mg MGO/片骨水泥浸提液同样引起p38磷酸化激活。

4 讨论

本研究证实MGO能有效抑制PJI相关病原体伪中间葡萄球菌的生长，减少细菌对骨水泥表面的定植和宿主细胞感染。其抗菌机制可能与AGEs形成、表面蛋白功能破坏以及毒力因子表达抑制有关。然而，MGO的细胞毒性限制了其应用，高浓度MGO通过激活p38 MAPK通路引起细胞应激反应，影响细胞活性和增殖。值得注意的是，MGO并未引起IL-6和IL-1β释放增加，这可能与骨水泥成分的干扰作用有关。

与既往研究相比，本研究发现MGO对伪中间葡萄球菌的MIC值（0.15 mg/mL）与其他PJI相关病原体相当。骨水泥中添加25 mg MGO/片能有效抑制生物膜形成，这对预防PJI具有重要意义，因为即使少量细菌也能在植入物表面引发感染。低于MIC浓度的MGO（0.05 mg/mL）能减少细菌对宿主细胞的粘附和内化，这可能是通过干扰细菌表面蛋白（如纤维连接蛋白结合蛋白）功能实现的。

在生物相容性方面，MGO对HOS细胞活力的IC₅₀（0.17 mg/mL）略高于其MIC，表明在抗菌浓度下细胞毒性较低。然而，增殖实验显示的U型剂量反应曲线提示MGO可能存在 hormesis效应，即低剂量刺激和高剂量抑制的现象。这种复杂效应需要进一步研究其分子机制。

骨水泥浸提液实验模拟了体内药物释放情况，结果显示高浓度MGO浸提液（特别是25 mg MGO/片在1 mL和3 mL培养基中）对细胞活性和增殖有显著影响，这表明在实际应用中需要谨慎控制MGO的释放浓度。令人意外的是，MGO处理并未引起IL-6和IL-1β释放增加，这与糖尿病研究中MGO促炎作用的报道不同，可能源于骨水泥成分的修饰作用。

p38 MAPK通路的激活表明MGO引起了细胞应激反应，这可能通过诱导凋亡影响细胞存活。这一发现与既往研究一致，即MGO可通过p38通路诱导细胞凋亡。因此，在将来应用中需要优化MGO浓度，以避免引起植入物周围细胞的应激和凋亡。

本研究存在一定局限性：未定量测定骨水泥中MGO的实际释放量；未包含多种骨细胞类型；未评估MGO对骨水泥机械性能和热稳定性的影响。未来研究应关注这些方面，并考虑采用纳米管封装等技术提高MGO稳定性。

5 结论

MGO作为骨水泥抗菌添加剂，能有效抑制PJI相关伪中间葡萄球菌的生长和生物膜形成，减少宿主细胞感染。在抗菌浓度下，MGO表现出可接受的细胞毒性，但高浓度会通过激活p38 MAPK通路影响细胞活性和附着能力。进一步研究需要优化MGO的生物相容性，解决其稳定性和释放动力学问题，以推动其在生物医学器械中的应用。