综述：H+电容器与ATP生产在专性嗜碱芽孢杆菌科中的作用：细胞色素c和H+转运机制的见解

本综述系统探讨了专性嗜碱芽孢杆菌科细菌在碱性环境中利用稀缺H+离子驱动ATP合成的独特机制。作者提出膜结合细胞色素c通过其N端天冬酰胺富集区形成氢键网络，构建H+电容器（H+-capacitor），协同DUF2759结构域蛋白将质子高效传递至F1F0-ATP合酶。该机制通过调节跨膜电位（ΔΨ）和质子亲和梯度，显著提升在高pH环境下的ATP合成效率，为极端微生物能量代谢研究提供了新视角。

　　

2 Taxonomic background of alkaliphilic Bacillaceae

自1934年Vedder从健康人粪便中分离出Alkalihalobacillus alcalophilus以来，多种嗜碱芽孢杆菌科菌株陆续从土壤、动物粪便和湖泊等环境中被发现。专性嗜碱菌无法在中性pH生长，而兼性嗜碱菌在碱性和中性环境均能生长。系统发育分析显示，Halalkalibacterium、Alkalihalobacillus和Shouchella属构成兼性嗜碱菌大分支，而Salisediminibacterium、Salipaludibacillus和Evansella属形成专性嗜碱菌分支。值得注意的是，Alkalibacillus haloalkaliphilus可在pH 7.5-13范围内生长，表明不同类群采用不同的高pH适应策略。

3 Metal acquisition in alkaliphilic Bacillaceae

嗜碱芽孢杆菌科面临金属离子利用的特殊挑战。在pH 10环境下，铁的生物利用度仅约10^-23 M，远低于pH 7时的10^-18 M。为应对铁缺乏，微生物分泌铁载体（siderophores）强力结合Fe³⁺并促进其转运。Alkalihalobacillus pseudofirmus OF4基因组包含六基因簇（asbABCDEF）负责合成儿茶酚酸盐铁载体，其旁侧还有编码ABC型铁载体转运蛋白的FhuGB和FhuRD基因。此外，细胞表面酸性聚合物（如teichuronopeptide、teichuronic acid和S-layer蛋白A）通过吸附铁氧化物来积累铁元素，减少Fe³⁺的直接毒性。

4 Bioenergetics in alkaliphilic Bacillaceae

根据Mitchell化学渗透理论，驱动F₁F₀-ATP合酶的H⁺动力（Δp）由跨膜电位（Δψ）和pH梯度（ΔpH）组成：Δp = Δψ – ZΔpH（Z≈59 mV，25°C）。兼性嗜碱菌A. pseudofirmus OF4在pH 10.6时生长速率和Δp分别为1.10 h^-1和-26 mV，而在pH 7.5时分别为0.77 h^-1和-140 mV，表明基于体相的Δp不能反映真实生物能量参数。研究推测呼吸链转运的H⁺可能直接传递给F₁F₀-ATP合酶的H⁺流入通道。

5 Structure and function of cytochromes c

5.1 Neutralophilic cytochromes c

中性菌Bacillus subtilis的细胞色素c-551由112个氨基酸组成，处理后形式含92个氨基酸（18个酸性氨基酸，14个碱性氨基酸），通过N端半胱氨酸的二酰甘油基团锚定在膜上，氧化还原电位高于+100 mV。Geobacillus sp. PS3的同类细胞色素以三聚体形式存在。

5.2 Facultative alkaliphilic cytochromes c

兼性嗜碱菌Sutcliffiella cohnii YN-2000在pH 10时细胞色素c-553表达量升高，该蛋白分子量10.5 kDa，形成四聚体，含93个氨基酸（14个酸性氨基酸，7个碱性氨基酸），氧化还原电位为+87 mV（pH 6-8）。Sporosarcina pasteurii细胞色素c-553的氧化还原电位低至+47 mV，其结构特征表明大部分电荷位于蛋白分子与膜外表面的交界区域。

5.3 Cytochromes c from obligate alkaliphiles

专性嗜碱菌Evansella clarkii K24-1U的细胞色素c-550在天然电泳中呈二聚体（23 kDa），凝胶过滤显示为四聚体（40 kDa），通过C₁₅-C₁₇脂肪酸锚定在膜上。氧化还原电位测定显示pH 7-9时为+83 mV，而循环伏安测量为+7 mV（pH 6.8），这种差异可能源于电极电场引起的蛋白骨架重定向。

6 Comparison of amino acid sequences in cytochrome c and F₁F₀-ATP synthase

6.1 Cytochrome c

E. clarkii细胞色素c成熟蛋白的Asn₄-Asn₃₇序列包含10个酸性氨基酸、9个酰胺基侧链氨基酸和1个羟基侧链氨基酸，这些结构特征有助于在细胞色素c分子主体与膜外表面之间形成氢键网络。四聚体结构进一步增强了其H⁺传递特性，促进H⁺电容器在膜外表面的形成。

6.2 Cytochrome c moiety in complexes III and IV

复合物III和IV中的细胞色素c组分在专性嗜碱菌中也表现出较高的酸性氨基酸丰度和较低的碱性氨基酸含量，但与独立细胞色素c相比，天冬酰胺富集趋势不明显。所有细胞色素c协同工作，将呼吸链泵出的H⁺高效传递至F₁F₀-ATP合酶。

6.3 DUF2759 domain-containing protein and F₁F₀-ATP synthase: a- and c-subunits

F₁F₀-ATP合酶a亚基的N端序列在专性嗜碱菌中显示出去质子化酸性氨基酸略多于碱性氨基酸的特点。小膜蛋白BpOF4_01690（含DUF2759结构域）暴露4个或3个碱性氨基酸和1个酸性氨基酸，可能在F₁F₀-ATP合酶H⁺流入通道附近招募H⁺。酸性减碱性氨基酸残基数量在E. clarkii的各个H⁺传递区段分别为：细胞色素c N端域(+10)、DUF2759蛋白(-2)、a亚基H⁺流入通道(+1)和胞内侧(-6)，这种质子亲和梯度差异促进了H⁺从电容器到ATP合酶的传递。

7 Bioenergetic parameter and capacitance formation

7.1 H⁺ translocation frequencies

专性嗜碱菌E. clarkii和兼性嗜碱菌S. cohnii的耗氧率低于中性菌B. subtilis，这可能源于其较高的膜电位（Δψ）对带正电质子 translocated 的阻碍作用。嗜碱菌的H⁺/O比值也低于B. subtilis，表明细胞色素c介导的H⁺在膜外表面积聚产生了反压效应，限制了呼吸链的进一步H⁺转运。

7.2 Transmembrane electrical potential

跨膜电位（Δψ）的测量通常采用膜通透性阳离子探针，通过能斯特方程计算。Donnan电位是细菌Δψ的重要来源，当带负电分子不能透过膜时，在膜内侧聚集形成电位差。全基因组分析显示专性嗜碱菌E. clarkii比兼性嗜碱菌S. cohnii和中性菌B. subtilis更偏好酸性氨基酸，这种特性导致其具有更高的固有非激发Δψ（Δψ_NE），进而贡献于更高的激发Δψ（Δψ_E）。

7.3 Efficiency of ATP production

基于内源底物的实验表明，E. clarkii的最大ATP合成效率 per H⁺ extrusion rate 比S. cohnii高约3.4倍，比B. subtilis高约130倍。这种高效率不能仅用高Δψ_E解释，H⁺电容器功能通过细胞色素c在膜外表面积聚和传递H⁺，创造了额外的跨膜电化学H⁺电位不平衡，从而更有效地驱动F₁F₀-ATP合酶。

8 Conclusion and perspective

专性嗜碱菌E. clarkii通过其细胞色素c N端天冬酰胺富集区形成氢键网络，构建H⁺电容器机制，协同DUF2759结构域蛋白将质子高效传递至F₁F₀-ATP合酶。该机制通过显著的质子亲和梯度（酸性减碱性氨基酸残基数量在关键区段分别为+10、-2、+1和-6）和高的跨膜电位（Δψ），显著提升了在高pH环境下的ATP合成效率。未来需要通过突变蛋白验证细胞色素c-550 N端序列的生理功能，阐明氨基酸序列与H⁺保留能力的关系，并鉴定参与细胞内负离子容量的物质及其调控机制。