免疫检查点抑制剂相关关节炎中滑液调节性T细胞的单细胞蛋白组学特征及其与疾病活动的相关性

本研究发现免疫检查点抑制剂相关关节炎（CBIA）患者滑液中存在独特的免疫活化型调节性T细胞（Treg）亚群，其特征性表面标志物（ICOS+CD134+CD137+）和炎症因子分泌谱（MCP1/MCP4+）与临床疾病活动度（mCDAI）呈正相关，为CBIA的病理机制提供了新的单细胞蛋白组学见解。

　　

引言

在过去的十年中，免疫检查点阻断疗法（CBI）已成为抗癌治疗的基石之一，成功延长了多种癌症患者的生存预后。然而，CBI可能引起称为免疫相关不良事件（irAEs）的副作用，显著限制了其临床适用性。其中最常见且日益受到研究的irAE类型是免疫检查点阻断相关炎症性关节炎（CBIA），发生在10%至20%接受CBI治疗的患者中。CBIA表现出与大多数其他风湿性炎症性关节炎相似的症状，包括关节疼痛和肿胀。然而，CBIA往往具有持续的临床病程，即使及时管理和停止CBI治疗。类固醇抗炎治疗在急性情况下可能有效，但长期使用类固醇可能引发对抗癌治疗受损的担忧。先前报告指出，目前二线管理基于临床经验和专家意见，因此有必要进一步研究其发病机制以进行适当管理。

CBI带来的关节组织损伤的一个重要机制是除了肿瘤内检查点阻断外，系统性脱靶激活T细胞，关节内T细胞激活被认为是CBIA的可能机制之一，尽管T细胞亚型尚不清楚。调节性T细胞（Treg）谱系在维持正常组织的免疫稳态和自身耐受中发挥关键作用，其在自身免疫疾病中变得失调。作为CD4⁺ T细胞的一个亚型，它们表达关键转录因子FoxP3，驱动后续免疫抑制标志物和细胞因子的表达。总体而言，典型Treg细胞谱系以CD25⁺CD127^dim表型为特征，分泌免疫调节细胞因子，包括IL-4、IL-10和TGFB。研究表明CBIA具有自身免疫背景，一些病理特征可能在细胞水平上模拟类风湿关节炎（RA）。然而，Treg谱系的亚群尚未被识别，这可能揭示两种病理类型之间失调的自身耐受差异，并为CBIA的自身免疫背景提供进一步证据。先前的CBIA和RA单细胞研究表明，具有非典型特征的Treg细胞比例减少，尽管Treg谱系的亚群尚未阐明。

在本研究中，我们旨在识别CBIA和RA之间关节内Treg细胞的膜蛋白表达差异，与非自身免疫炎症对照（NIC）相比，以发现CBIA特异性Treg细胞表型。我们设计了一个包含77个Treg细胞表面和细胞标志物的抗体结合面板，参考了先前研究的细胞表型研究。接下来，通过实验室技术分离关键细胞亚型，我们旨在单细胞水平识别细胞因子分泌模式，展示CBIA特异性Treg亚群的功能状态。

方法

设置和参与者

在这项前瞻性、单中心队列研究中，我们招募了在PD-1或PD-L1阻断治疗后诊断为新发CBIA的参与者。患者于2020年12月至2023年5月在汕头大学医学院附属肿瘤医院入组。人类研究协议经汕头大学医学院附属肿瘤医院机构审查委员会审查和批准（编号2023100；2023年7月14日），参与者提供了所需的知情同意。采样程序遵循赫尔辛基宣言进行。与人口统计学变量、治疗历史和参与者影像学研究相关的信息从电子医疗记录中获取，所有参与者数据均去标识化。数据报告和分析遵循加强流行病学观察性研究报告（STROBE）队列研究清单。

本研究旨在探索CBIA患者活动期关节内Treg细胞的独特表型。因此，实验使用三组参与者的样本进行，即CBIA组、RA组和NIC组，以实现组间比较。活动性CBIA的诊断标准如下：1）通过风湿病学家医学检查、血清炎症生物标志物CRP和ESR以及MRI或超声影像分析诊断的活动性关节炎症；2）癌症患者开始检查点阻断剂后出现的症状。关键排除标准包括自身免疫风湿疾病的历史或当前状态。活动性RA根据2010年美国风湿病学会/欧洲抗风湿病联盟（ACR/EULAR）标准诊断。NIC患者定义为接受CBI治疗的癌症患者，无CBIA或任何其他自身免疫条件，因创伤性或感染性膝关节肿胀（非自身免疫病因）接受膝关节液抽吸。

患者采样和评估

所有CBIA和RA样本在活动期收集，记录疾病发作时间。基线信息包括性别、年龄、发作时间、癌症管理和关节炎管理。由于Treg百分比随年龄变化，所有研究组均进行年龄和性别匹配。为分析关键细胞类型与临床相关性的关系，我们采用改良临床疾病活动指数（mCDAI）评估CBIA发作期的严重程度。mCDAI评分通过求和以下项目计算：压痛关节数、肿胀关节数、患者主观评估评分（1-10）和医生评估评分（1-10）。对于CBIA和RA，血清阳性关节炎定义为存在抗瓜氨酸肽抗体（ACPA）和类风湿因子（RF）。我们额外参考不良事件通用术语标准（版本5.0）进行CBIA症状严重性描述和评级。

通过膝关节穿刺术从CBIA、RA和NIC患者采集滑液（SF）。从CBIA和RA患者抽取外周血（PB）。CBIA和RA的SF和PB作为风湿科临床常规护理中的废弃样本获取。NIC患者样本作为研究志愿者从肿瘤学设置中主动招募，并给予适当补偿。SF在膝关节受累发作期间收集，与CBIA或自身免疫条件无关。通过Ficoll-Paque梯度离心从SF和PB分离细胞。通过CD4⁺CD25⁺CD127^dim微珠（Miltenyi Biotec, Cologne, Germany, #130-094-775）阳性选择富集Treg⁺细胞。

单细胞膜蛋白组学和分泌蛋白组学

在第一个测序步骤中，对Treg细胞进行单细胞膜蛋白组学，通过使用77种抗体的表面蛋白定量识别独特表型。基于膜蛋白组学结果，从CBIA患者SF来源的Treg进行磁珠分选：使用CD137微珠分选Treg亚群以分离免疫活化细胞。为进行比较验证，同样使用CD137珠从CBIA和RA患者分选PB来源的免疫活化Treg。在第二个测序步骤中，对SF和PB来源的免疫活化Treg进行单细胞分泌蛋白组学，使用单细胞分泌组适应性免疫芯片-4（人，32重）面板。如此，本研究旨在单细胞蛋白组学水平分析独特细胞类型的细胞因子和膜表型。

样本制备协议先前已发布。膜蛋白组学的细胞染色使用单细胞多重检测试剂盒（#633781, BD Biosciences, Franklin Lake, New Jersey, USA）和77种寡核苷酸偶联AbSeq抗体（BD Biosciences, Franklin Lake, New Jersey, USA，见补充表1）的主混合物，在PBS + 2% FBS中冰上孵育45分钟。用冷BD样本缓冲液洗涤三次后，细胞重悬于20,000–30,000细胞/mL，加载到BD Rhapsody盒（#633733; BD Biosciences, Franklin Lake, New Jersey, USA）进行单细胞捕获。使用CD137微珠（Miltenyi Biotec, Cologne, Germany, #130-093-476）分离免疫活化Treg亚群，通过在PBS/0.5% BSA/2 mM EDTA缓冲液（细胞密度≤10⁸/mL；每10⁷细胞10 μL珠）中4°C孵育15分钟，随后进行柱基分离，其中微珠^?细胞在流穿中收集，微珠⁺细胞在柱移除后洗脱。类似地，通过阳性选择使用相同微珠从PBMC分选免疫活化Treg亚群。所有分选亚群在>95%存活率下冷冻保存（Ficoll-Paque Plus; GE Healthcare, Chicago, Illinois, USA）。样本解冻后在完全RPMI培养基（Fisher Scientific, Massachusetts, USA）中以1 * 10⁵细胞/mL密度培养，并用Ficoll-Paque Plus培养基（GE Healthcare, Chicago, Illinois, USA）从死细胞中纯化活细胞。细胞悬液以每芯片1,000–2,000细胞加载到单细胞分泌组适应性免疫芯片（Bruker Cellular Analysis, ISOCODE-1001-4）上，使用32重面板，在37°C、5% CO₂下孵育24小时过夜（补充表2）。分泌蛋白通过IsoLight平台上的荧光ELISA检测捕获和定量，并使用IsoSpeak软件分析。

单细胞数据分析

数据处理协议先前已发布。所有患者处理相同的滑液体积。通过量化每个样本的CD45⁺活细胞对Treg频率进行标准化，以确保跨样本可比性。使用R统计（版本4.3.1）上的“Seurat”包进行清洗和自动聚类。非条形码细胞和任何覆盖<20细胞的抗体被排除分析。使用所有质量控制蛋白进行主成分分析（PCA）降维。然后，采用均匀流形近似和投影（UMAP）进行无监督自动聚类。对于膜蛋白组学（CBIA、RA和NIC），UMAP使用11个主成分（PCs），聚类分辨率为0.3。对于CBIA中免疫活化Treg的分泌蛋白组学，UMAP使用6个PCs（分辨率=0.1）。对于CBIA和RA之间免疫活化Treg的分泌蛋白组学，UMAP投影使用5个PCs（分辨率=0.1）。采用“FindAllMarkers”嵌入识别每个聚类中的标志蛋白，与所有其他聚类的差异为0.25，细胞比例阈值设为0.25。在条形码抗体计数对数转换和居中之前进行全局缩放。通过参考CellMarker（版本2.0）对单细胞膜蛋白组学定义的聚类进行注释。

统计

连续变量用小提琴图和点图可视化，统计计算在R统计（版本4.3.3）和GraphPad Prism（版本9.5.1, GraphPad Software）上进行。可比数据通过非参数Wilcoxon符号秩检验分析，使用Benjamini–Hochberg（BH）校正对p值进行多重比较调整。对每个患者的聚类比例和mCDAI评分进行Pearson相关分析。

结果

基线信息和细胞聚类

我们首先旨在测试CBIA患者SF Treg细胞的细胞标志物，与RA和NIC两个对照组不同。为此，对15名CBIA患者、12名RA患者和11名NIC志愿者的CD4⁺CD25⁺CD127^dim细胞进行单细胞膜标志物面板测试。CBIA组包括9名男性和6名女性，中位年龄54岁（四分位范围40-69岁），具有多种癌症类型和CBI类型。这些患者自开始CBI的中位发作时间为5周（范围1-23周），中位mCDAI评分为21（范围14-28）。他们均接受静脉类固醇联合其他抗炎治疗，10名患者有持久临床反应。所有患者ACPA或RF血清学阴性。CBIA、RA和NIC组的人口统计学和治疗信息见表1。

总体而言，合并的SF单细胞膜蛋白组学数据包含60,508个质量控制的细胞谱系，来自所有三组，包括23,337个来自CBIA组的细胞，19,973个来自RA组的细胞，和17,198个来自NIC组的细胞。从个体患者分离的细胞数量提供在补充表3中。基于无监督聚类，识别出七个聚类，并可视化为UMAP图（图1A，补充图1A），最大聚类包含11,136个细胞，最小聚类包含5,934个细胞（补充图1B）。聚类1主要由CBIA患者的细胞填充，而聚类4主要由RA组的细胞填充（图1B、C）。其他聚类在三组之间无显著差异（图1C）。患者水平分析显示，聚类1和4相对于其他聚类有≥2倍差异（图1D，补充图1C）。这些发现初步表明CBIA和RA组的聚类1和4具有不同的细胞表型，与NIC组对比。

CBIA和RA组的Treg细胞表现出共同和独特的免疫活化表型标志物

无监督聚类使我们能够进一步识别与通过跨聚类比较的差异表达蛋白（DEP）水平定义的细胞聚类相关的特定标志物。使用Seurat包，我们绘制了点图显示每个聚类的10个最高DEP（图1E）。总体而言，所有聚类均高表达Treg特征标志物，包括CD3、CD4、CD25和FOXP3，以及低表达IL-7R（图1E，补充图2A）。有趣的是，所有聚类均中表达CD103，这是一个指示局部抗原表达的标志物。根据T细胞分期的一般分类原则，我们然后基于CD45RA和CCR7对这些聚类按成熟阶段进行注释：中央记忆Treg（CD45RA^?CCR7⁺，聚类0），效应记忆（CD45RA^?CCR7^?，聚类1、2、3、5和6），和终末效应（CD45RA⁺CCR7^?，聚类4）（图1F，补充图2B）。CCR7和CD45RA分别反映Treg细胞的功能状态和分布，其中CCR7与淋巴细胞的组织定位相关，而CD45RA广泛用于区分幼稚细胞和成熟细胞。

聚类1和4，这两个CBIA和RA的独特聚类，表现出显著不同的表型。与其他聚类相比，它们均显著降低经典Treg细胞抑制标志物的表达水平，包括但不限于CTLA4、VISTA、LAG3和VTCN1（图1E，补充图3A-C）。另一方面，它们均共享高表达刺激标志物，包括CD137、CD134和ICOS（图1E，补充图3D），因此定义为免疫活化细胞聚类。这些发现初步表明，RA和CBIA中的两个特定Treg细胞聚类可能朝向免疫刺激效应非典型，与典型的免疫抑制表型相比。当分别分析它们的聚类特征时，我们发现聚类1以几种趋化标志物为特征，包括CX3CR1、CCR4、CXCR4和CD69（图1E、F）。有趣的是，聚类4以CD18和CD11a表达为特征（图1E，补充图4），这是异源二聚体LFA1的两个重要组成部分。这一证据表明，尽管两个聚类都是刺激型非典型Treg细胞，但CBIA特异性Treg以趋化表型为特征，而RA特异性Treg以粘附表型为特征（补充图5）。

CBIA患者中免疫活化+ Treg相对于RA患者的独特分泌细胞因子

考虑到我们研究中聚类1（注释为CBIA特异性免疫活化Treg，与CBIA组不同）的免疫表型表现出Treg细胞的非典型表型，并且这种活化类型可能与CBIA病理状态相关，我们然后旨在研究此类细胞在CBIA患者中的分泌细胞因子，以在细胞水平确定其分泌功能。在CBIA患者样本中，我们发现ICOS⁺CD134⁺CD137⁺几乎 exclusively 在此聚类中表达，因此，采用CD137微珠进行阳性和阴性分选细胞，产生免疫活化和CD137^?细胞组。这些分选细胞在商业32蛋白芯片上进行单细胞分泌蛋白组学（补充表2）。这些细胞因子涵盖多种功能，包括细胞毒性效应、趋化性、细胞刺激、免疫调节和炎症。我们最终为单细胞分泌蛋白组学协议获取了15,819个质量控制的细胞，包括5,284个免疫活化细胞和10,535个CD137^?细胞。从个体患者分离的细胞数量提供在补充表3中。通过无监督聚类，这些细胞自动聚集成六个聚类，如UMAP图所示（图2A，补充图6A），最大聚类包含3,126个细胞，最小聚类包含1,554个细胞。

聚类0、2和3主要由CD137^?组的分泌细胞填充，而聚类1主要由免疫活化组的细胞填充（图2B、C）。聚类1在患者水平表现出至少两倍差异（图2D，补充图6C）。其他聚类无显著差异。这些发现初步表明免疫活化细胞与CD137^?细胞具有不同的分泌功能。然后，基于细胞因子分泌对这些聚类进行注释（图2E）。具体而言，聚类1以MCP1和MCP4为特征，这是炎症的关键细胞因子（图2F）。与典型Treg细胞功能一致，然而，聚类0、2和3以高水平的IL4、IL-10和TGFB1分泌为特征，在CD137^?细胞中展示免疫调节功能（图2E、F，补充图6D）。总体而言，这些发现验证了CBIA患者SF来源的免疫活化细胞，而非CD137^?细胞，在细胞功能水平上在炎症中发挥关键作用。

单细胞膜蛋白组学分析显示，CBIA和RA均表现出非典型刺激效应，而非经典调节效应。为进一步识别CBIA和RA中免疫活化Treg细胞的差异，我们通过Treg和CD137磁珠分离试剂盒从当前参与患者中的七名CBIA患者和六名RA患者获取外周血。这些分选细胞进行32蛋白的单细胞分泌蛋白组学（补充表2）。我们最终为单细胞分泌蛋白组学获取了11,229个细胞，包括CBIA组5,748个细胞和RA组5,481个细胞（具体每人细胞数见补充表3）。通过无监督聚类，这些细胞自动聚集成四个聚类，如UMAP图所示（补充图7A），最大聚类包含3,412个细胞，最小聚类包含2,285个细胞（补充图7B）。

聚类0主要由来自CBIA的免疫活化Treg的分泌细胞填充，而聚类1主要由来自RA的免疫活化Treg组的细胞填充（补充图7B-D）。患者水平分析显示，聚类0和1相对于其他聚类有≥4倍差异（补充图7E、F）。其他聚类无显著差异。这些发现初步表明CBIA中免疫活化Treg与RA中具有不同的分泌功能。然后，基于细胞因子分泌对这些聚类进行注释（补充图7G）。具体而言，聚类0以MCP1和MCP4为特征，这是炎症的关键细胞因子。然而，聚类1以高水平的CCL11和CXCL10分泌为特征，展示趋化功能（补充图7G）。这些表明免疫活化Treg细胞在CBIA患者中表现出与RA患者不同的分泌细胞因子，这可能代表细胞功能水平上不同的免疫机制。

滑液来源的免疫活化Treg细胞与疾病活动相关

我们阐述了CBIA患者中独特的Treg细胞的免疫表型，这些独特细胞是具有活跃分泌功能的免疫活化细胞。这些微环境在多大程度上与临床特征相关尚未解决。在此，我们对我们发现与疾病活动进行关联分析，主要指定为mCDAI评分，以阐述单细胞聚类的临床意义。在单细胞膜蛋白组学定义的聚类中，聚类1比例与mCDAI评分正相关（图3A），并且也与临床CRP值和CTCAE评级相关，后者代表不良效应的严重性（补充图8）。在CBIA患者的SF来源免疫活化Treg中，聚类1比例与mCDAI评分正相关（图3B），并且也与临床CRP值和CTCAE评级相关（补充图9）。在CBIA和RA的PBMC来源免疫活化Treg中，聚类0和1比例分别与mCDAI评分正相关，具有不同的细胞功能（补充图7H、I）。所有其他聚类比例与mCDAI评分负相关。这些发现一致验证了免疫活化Treg细胞与疾病活动正相关。

讨论

在本研究中，通过单细胞膜和分泌蛋白组学实验，我们分析了CBIA患者关节内Treg细胞的表型和分泌细胞因子，与RA和NIC患者组中的那些细胞进行比较。我们主要识别了一个MCP1/MCP4⁺多分泌免疫活化Treg细胞亚群，展示出表型和功能上的免疫活化模式，并且该亚群与CBIA患者的临床疾病活动（mCDAI评分）呈正相关。这一发现证实了先前报道的CBIA病因中Treg细胞失调的假设，该病被认为是一种自身免疫T细胞介导的医源性疾病。考虑到在CBIA中发现的非典型表型和相应的分泌功能，我们的研究阐述了炎症性关节炎中Treg细胞的景观，并阐明了在大型队列中Treg细胞亚群的功能。

Treg细胞在调节正常组织的免疫稳定性和炎症抑制中发挥关键作用，具有多种表面标志物的经典表达表明免疫抑制，包括VISTA、CTLA4、ILT3和ILT7。然而，Treg细胞在自身免疫条件中可能变得失调，例如RA，文献综述表明RA患者表现出减少的Treg细胞群体，表面免疫抑制标志物表达减少。一致地，我们识别到RA患者特异性Treg细胞表达许多抑制或免疫调节标志物的水平降低。另一方面，先前对CBIA的研究显示滑液中Treg群体减少，但确切表型尚不清楚。在本研究中，我们显示CBIA中关节内Treg细胞表现出与RA患者Treg既相似又独特的免疫活化特征。例如，CBIA中的Treg细胞与RA组共享激活标志物表达增加的特征，包括CD137（TNFRSF9或4-1BB）、CD134和ICOS，而两组共享免疫抑制标志物表达减少的特征。作为我们研究中的特殊发现，CBIA患者中Treg细胞的独特特征不与RA共享，包括高水平的趋化标志物，如CXCR4、CXCR6和CCR4，而RA患者表现出CD11a、CD11b、CD18以及重要的是CD45RA水平增加。这些发现共同表明与RA患者不同的Treg细胞活动，鼓励未来研究解决差异。

我们研究中Treg细胞的一个关键发现是在识别独特表型特异性于CBIA患者关节内Treg细胞后， notable 相应的分泌细胞因子分析。通过比较免疫活化Treg细胞与阴性分选细胞的单细胞分泌蛋白组学，我们发现免疫活化细胞组在功能上与其表型一致，具有多种炎症细胞因子分泌，主要包括MCP1和MCP4。相反，具有免疫抑制功能的细胞因子在免疫活化细胞组中发现，包括分泌IL-10、IL-4和TGFB1的细胞聚类。关键地，我们整合的PB来源分泌组蛋白组学证明，CBIA中的免疫活化Treg优先分泌促炎MCP1/MCP4，而RA免疫活化Treg产生趋化因子CCL11/CXCL10—功能上与滑液观察一致，并强调疾病特异性Treg极化。这些结果表明关节内Treg细胞的表型和分泌功能在蛋白水平一致，并且CBIA特异性Treg细胞主要展示免疫刺激和促炎功能。最后，在CBIA患者中，我们将其临床疾病活动与单细胞定义的聚类比例相关联，并阐述了正相关，强调了MCP1/MCP4分泌免疫活化Treg在CBIA疾病进展中的作用。

CBIA特异性Treg分泌MCP1/MCP4的生物学意义值得强调。在RA患者中，MCP1（CCL2）和MCP4（CCL13）是滑膜炎的既定介质：MCP1通过CCR2招募单核细胞，驱动巨噬细胞浸润和破骨细胞生成，加速关节破坏，而MCP4/CCL13通过细胞外信号调节激酶丝裂原活化蛋白激酶级联信号直接激活成纤维样滑膜细胞增殖，放大软骨降解。然而，CBIA反映了由免疫检查点抑制剂（ICIs）触发的急性T细胞失调。关键地，我们的研究揭示了CBIA中一个不同的致病作用：此处，免疫活化Treg特异性过量产生MCP1/MCP4（而非RA相关趋化因子如CCL11/CXCL10），创建一个前馈循环维持滑膜炎症。这与关于irAE发病机制的新兴证据一致。在ICIs诱导的神经毒性中，升高的MCP1引发T细胞过度激活并破坏免疫耐受—这一过程在我们CBIA队列中镜像，其中MCP1/MCP4⁺ Treg与CTCAE等级相关。因此，CBIA中失调的Treg可能通过MCP1/MCP4主动助长炎症，这是一种在常规自身免疫关节炎中未报告的现象。然而，这一发现受样本量限制，应谨慎解读，鼓励更大规模队列以增强我们的发现。

治疗上，靶向MCP1/MCP4–CCR2/CCR3轴对CBIA有前景。CCR2抑制剂在RA模型中抑制单核细胞迁移，但它们在CBIA中的功效可能扩展到阻断Treg–T细胞串扰。值得注意的是，联合阻断MCP1和MCP4未能在RA滑膜中协同抑制单核细胞招募，可能因为CCL13和CCL2共同使用单核细胞上的趋化因子受体CCR2，因此CCL13阻断与CCL2一样有效。因此，类似策略可能破坏CBIA的炎症回路。

限制

尽管我们阐述了关节内Treg细胞的免疫景观并识别了疾病特异性细胞聚类，但存在几个限制。首先，如前所述，尽管我们获得了足够大的数据集用于单细胞水平表型分析，但患者样本量对于临床相关性相对较低。其次，由于采样困难和单细胞协议导致的细胞损失，每个患者的细胞计数相对较低。第三，使用膜和分泌蛋白组学的技术受商业制造抗体数量限制。与涵盖广泛RNAs的转录组测序不同，该技术通过抗体数量引起偏倚分析，因此细胞聚类识别可能不准确。进一步限制是缺乏关节炎或骨关节炎对照，这将为区分CBIA和RA队列中炎症特异性Treg失调提供更强的比较背景。最后，缺乏正交验证（例如，表面标志物的流式细胞术，组织定位的免疫组化）和独立纵向队列需要谨慎解读。

结论

我们分析了CBIA患者滑液来源Treg细胞的表型和细胞因子，并与RA和NIC患者组进行比较。我们识别了一个MCP1/MCP4⁺多分泌免疫活化Treg亚群作为CBIA中独特的致病贡献者，显示与临床疾病活动和系统性炎症标志物的显著关联。