非离子型去垢剂Tween 20灭活的成熟登革病毒颗粒保留四级中和表位并诱导强效中和抗体

本刊推荐：本研究创新性地利用非离子型去垢剂Tween 20灭活成熟登革病毒（mDENV）颗粒，发现该方法较甲醛（formalin）和紫外线（UV）灭活能更好地保留关键中和表位（如EDE、DI/II hinge等四级表位），并维持病毒膜完整性。机制研究表明Tween 20通过抑制病毒结合细胞、阻止酸性构象变化及介导RNA降解实现灭活。动物实验显示该灭活颗粒可诱导高滴度广谱中和抗体（NT50），且显著降低融合环（FL）抗体比例，为开发安全有效的登革热疫苗提供了新策略。

　　

引言：登革病毒（DENV1-4）是全球最重要的虫媒病毒病原体，每年导致约3.9亿人感染。当前登革疫苗开发面临巨大挑战，已上市的减毒活疫苗（如Dengvaxia^?和Qdenga^?）存在血清型间保护不平衡及潜在抗体依赖性增强（ADE）风险。研究表明，成熟登革病毒颗粒（mDENV）缺乏prM蛋白且融合环（FL）表位可及性低，能优先被强效中和单克隆抗体（mAbs）识别，而FL和prM抗体多为弱中和性且可能介导ADE，因此mDENV被视为理想疫苗候选抗原。传统灭活方法（如甲醛、紫外线）可能破坏病毒抗原表位，而非离子去垢剂Tween 20（聚山梨酯20）作为FDA批准的安全佐剂，此前未被用于疫苗开发。

材料与方法：研究使用稳定表达弗林蛋白酶（furin）的Vero细胞生产mDENV1（夏威夷株）、mDENV2（新几内亚C株）和mZIKV（PRVABC-59株）颗粒。通过聚焦试验（focus assay）、蔗糖梯度超速离心和蛋白酶K消化实验评估病毒灭活效果及膜完整性。采用实时定量RT-PCR（qRT-PCR）分析病毒RNA拷贝数，细胞结合ELISA和酸性暴露实验探讨灭活机制。小鼠免疫实验使用BALB/c小鼠，以1 μg E蛋白当量的Tween 20灭活mDENV1加铝佐剂（Alhydrogel）进行三次腹腔注射，通过微量中和试验（MNT）、竞争结合ELISA和FL比例测定评估抗体反应。

结果：

Tween 20有效灭活DENV和ZIKV

1% Tween 20在37°C处理1小时可完全灭活mDENV和mZIKV，最低有效浓度为0.5%。灭活后病毒颗粒无法形成感染灶（FFU），且灭活效率高于22°C处理。

Tween 20灭活更好保留中和表位

与甲醛和UV灭活相比，Tween 20处理的mDENV1颗粒与14种人源mAbs的结合率更高（尤其是识别四级表位如EDE和DI/II hinge的抗体），相对结合率可达50-100%。类似结果在mDENV2和mZIKV颗粒中得到验证。

纯化后表位稳定性保持

通过蔗糖垫超速离心和Capto Core 400层析纯化的Tween 20灭活颗粒保持高纯度，Western blot显示E蛋白二聚体和单体条带完整，且纯化后颗粒仍无感染性。储存7个月后抗原性稳定。

膜完整性未受破坏

Tween 20处理不会像Triton X-100那样破坏病毒膜结构。蔗糖梯度沉降和蛋白酶K保护实验表明，病毒颗粒密度和内核蛋白（C蛋白）保护性均与未处理组一致。

灭活机制涉及多途径

Tween 20处理导致病毒RNA拷贝数下降约3 log₁₀，但直接RNA处理无影响，预加RNase抑制剂（RNaseOUT）可阻止降解，提示细胞外RNase参与此过程。此外，病毒与细胞结合能力显著降低，酸性暴露引发的E蛋白构象变化（如747C4表位丢失）被抑制。

诱导强效广谱中和抗体

免疫小鼠血清ELISA和中和抗体滴度（NT₅₀）随免疫次数显著上升，且两者正相关（Spearman检验）。竞争结合ELISA显示血清可高效抑制强中和mAbs（如EDE1 mAb 752.2B2，IC₅₀达1666），但对FL mAb抑制较弱。FL抗体比例仅6.8%，远低于自然感染人群。血清对DENV1-4均具中和活性（NT₅₀分别为35353、3191、4449和678）。

讨论：本研究首次证明Tween 20灭活的mDENV颗粒能显著保留关键中和表位，尤其四级构象表位，其机制涉及膜完整性维持、结合抑制和构象稳定。诱导的抗体以强中和类型为主，FL抗体比例低，降低了ADE风险。尽管中和反应存在血清型差异（对DENV4较低），但提示四价疫苗可能是未来方向。研究局限性包括mAbs覆盖范围有限和未纳入其他灭活方法对比。未来需开展非人灵长类攻毒实验验证保护效果。

结论：Tween 20灭活的成熟DENV颗粒是一种极具潜力的疫苗候选策略，可诱导高质量抗体应答，为登革热疫苗开发提供新路径。