小鼠初级视皮层第2/3层向侧向与内侧高级视区投射神经元亚型在神经发生时间上的差异性动力学

本文结合EdU（5-ethynyl-2′-deoxyuridine）出生日期标记与逆行病毒示踪技术，揭示小鼠初级视皮层（V1）第2/3层（L2/3）中向侧向（L-HVAs）与内侧（M-HVAs）高级视区投射的皮质-皮质投射神经元（CCPNs）在胚胎期神经发生时间上存在显著差异：L-HVA投射神经元更多在E15.5生成，而M-HVA投射神经元在E15.5与E16.5间无显著偏好。这一发现将神经发生时间与精细投射身份联系起来，为理解大脑皮层细胞类型多样性发育机制提供关键依据。

　　

引言

理解神经元多样性在发育过程中如何产生是神经生物学的核心问题。哺乳动物大脑包含多种细胞类型，其在形态、分子特征、生理特性、连接模式和解剖位置上存在差异。新皮质中的兴奋性神经元可根据其层状位置和长程连接被广泛分为几个主要投射类别，例如脑皮层内（IT或皮质-皮质投射神经元，CCPNs）、脑皮层外（ET）、皮质丘脑（CT）和近投射类型。然而，即使在单个皮层和同一投射类别中，进一步的亚类划分仍显示出显著的细胞多样性。

例如，在小鼠初级视皮层（V1）的第2/3层（L2/3）中，CCPNs投射到多个不同的高级视区（HVAs），并形成具有特定投射模式的解剖亚型。其中，投射到前外侧（AL）和后内侧（PM）高级视区的L2/3 V1→AL和L2/3 V1→PM神经元在很大程度上是非重叠群体，具有不同的特性。它们在视觉调谐偏好、局部环路连接、长程反馈选择性等方面均存在差异，很少共同投射到AL和PM，这些特征支持L2/3 CCPNs是由具有不同环路身份的离散亚型组成的观点。

一个尚未深入探讨的问题是这些亚型特异的投射身份是如何在发育过程中被指定的。线索可能在于它们的层状定位：L2/3 V1→AL神经元在L2/3中均匀分布，而L2/3 V1→PM神经元则更偏向浅表位置。由于皮层神经元按照由内到外的顺序生成，即更早出生的神经元定居在更深处，更晚出生的神经元迁移到更浅表的位置，因此我们假设出生时间对L2/3内的投射身份有贡献。

方法

实验动物与饲养

使用C57BL/6J野生型小鼠，雄性和雌性均被使用。所有小鼠饲养在12小时光照/12小时黑暗循环条件下，自由获取食物和水。所有动物操作均符合加州大学圣克鲁兹分校动物护理和使用委员会（IACUC）的规定。

EdU注射

将雄性和雌性野生型小鼠相互交配，交配窗口为12小时，每天检查雌鼠的阴道栓以确定受孕日期。检测到阴道栓的时间点被视为胚胎第0.5天（E0.5）。怀孕母鼠在E14.5、E15.5或E16.5时接受一次腹腔注射25 mg/kg的EdU。

病毒制备与立体定位动物手术

使用的腺相关病毒（AAVs）由Salk Viral Core生产，包括scAAVretro-hSyn-H2B-eGFP（简称AAVretro-eGFP）和scAAVretro-hSyn-H2B-mCherry（简称AAVretro-mCherry）。在出生后第47天至第92天（P47至P92）的小鼠中进行手术。小鼠通过腹腔注射含有80.4 mg/kg氯胺酮和8 mg/kg赛拉嗪的混合麻醉剂进行麻醉，并在整个手术过程中持续吸入1-3%的异氟烷气体。为了标记V1中投射到AL、PM和其他HVAs的神经元，将15-50 nL的AAVretro-eGFP或AAVretro-mCherry注射到目标HVA中。侧向或内侧注射中使用的荧光蛋白在每个动物之间交替使用。注射位点使用相对于人字缝的立体定位坐标进行定位。

组织学处理

病毒注射10天后，对小鼠进行经心灌注，使用含有肝素（10 U/mL）的1X磷酸盐缓冲盐水（PBS），随后使用4%多聚甲醛（PFA）进行固定。取出的大脑在4°C下用含有2% PFA和15%蔗糖的PBS后固定过夜，然后在4°C下浸入含有30%蔗糖的1X PBS中至少24小时，之后进行切片。使用滑动切片机切割50 μm的冠状脑切片，并存储在含有0.01%叠氮化钠或冷冻保护剂的1X PBS中。切片用1X PBS洗涤3次，每次10分钟，然后应用EdU染色溶液并在室温下避光孵育30分钟。切片再次用1X PBS洗涤3次，每次10分钟，随后与DAPI在室温下避光孵育30分钟。最后，切片用1X PBS再洗涤3次，使用含有DABCO的聚乙烯醇封片剂封片，并风干。

成像与量化

使用Keyence BZ-9000显微镜的4×/0.2 NA或10×/0.45 NA物镜对脑切片进行成像。对每个动物的注射位点进行评估，以确认标记仅限于适当的皮质视觉区域。使用Zeiss LSM 880共聚焦显微镜获取代表性图像。为了量化V1中的单标和双标神经元，根据Allen小鼠大脑通用坐标框架参考图谱勾画每个切片的皮质边界，并使用DAPI核复染基于细胞密度手动定义L2/3。手动计数AAVretro标记的神经元（AAV+）和双标的AAV+ EdU+神经元。由于EdU信号强度随着每次细胞分裂大约减少50%，因此绘制了每个ROI内单个神经元平均EdU+信号强度的分布图，并应用了相对于最亮EdU+细胞50%的截断值。该阈值用于识别可能在EdU注射时间附近出生的神经元。使用QuPath和自定义脚本自动检测单标的EdU+神经元，并应用相同的强度阈值。

统计分析

使用Python 3.12进行单因素方差分析（ANOVA）与Tukey HSD事后检验、Kruskal-Wallis检验或Pearson相关性检验来计算p值。在进行统计检验之前，使用Shapiro-Wilk检验和Levene检验分别评估数据的正态性和方差齐性。

结果

为了研究成年小鼠皮层（P47-P92）中靶向内侧（如AM或PM）与侧向（如AL、LM或RL）高级视区（HVAs）的L2/3 CCPNs的亚层分布，我们将AAVretro-eGFP或AAVretro-mCherry注射到内侧或侧向HVAs中。病毒注射10天后收集脑组织进行分析。对包含视觉皮层的冠状脑切片进行评估，以确认逆行AAVs准确靶向高级视区。荧光成像显示，投射到侧向和内侧视觉区域的V1 CCPNs在L2/3内的分布存在差异。具体而言，投射到PM或AM的V1 CCPNs（V1→M-HVAs）集中在L2/3 normalized depth的28.19 ± 2.61%处（从该层顶部测量）。相比之下，投射到AL、RL或LM的V1 CCPNs（V1→L-HVAs）在L2/3深度上分布更均匀，平均深度为43.59 ± 1.34%。这一分布模式与之前的报道一致。

小鼠皮层中的L2/3神经元主要在胚胎第14.5天至16.5天（E14.5至E16.5）之间生成。为了评估视觉皮层内的神经元出生时间，我们在E14.5、E15.5或E16.5对怀孕母鼠施用EdU。尽管在E14.5标记的一些EdU+细胞在L2/3中被检测到，但大多数位于第4层。相比之下，在E15.5和E16.5标记的EdU+细胞大量存在于L2/3中。其中，在E15.5标记的细胞位置显著深于在E16.5标记的细胞。

我们进一步量化了位于L2/3上半部分和下半部分的神经元比例。39.68%的V1→L-HVA CCPNs位于下半部分，而只有15.90%的V1→M-HVA CCPNs位于下半部分。同样，45.35%的E15.5出生的神经元位于该层的下半部分，而只有14.50%的E16.5出生的神经元显示出类似的定位。V1→L-HVA神经元的平均和中位体细胞深度均深于V1→M-HVA神经元，这一模式也反映在E15.5组与E16.5组的比较中。除样本ID S01外，该模式在所有个体样本中均一致，该样本显示出介于典型E14.5和E15.5模式之间的EdU+分布。

鉴于AL或侧向投射V1 CCPNs的体细胞分布与E15.5出生的L2/3神经元相似，以及PM或内侧投射V1 CCPNs与E16.5出生的L2/3神经元相似，我们假设侧向投射的V1 CCPNs主要在E15.5生成，而内侧投射的CCPNs主要在E16.5生成。为了检验这一点，我们量化了整个V1的L2/3内，AAVretro标记的侧向或内侧投射V1 CCPNs中EdU+神经元的比例。对于标记的V1→L-HVA CCPNs，E15.5组的EdU+神经元百分比显著高于E16.5组，支持了我们的假设。在AAVretro注射特异性靶向AL的动物中，这一趋势保持一致。相反，对于V1→M-HVA CCPNs，在E15.5和E16.5组之间未观察到显著的共定位差异。正如预期的那样，在E14.5进行的EdU掺入导致与AAVretro标记的CCPNs的共定位几乎为零，这与L2/3中E14.5出生的神经元数量少有关。

为了确定AAV和EdU共定位率是否受AAVretro注射位点空间位置的影响，我们分析了共定位百分比与注射中心相对于前囟的内侧-外侧和前-后坐标之间的关系。对于侧向注射，共定位百分比与距中线和中线及前囟的距离之间存在轻微的负趋势；然而，这些相关性在统计上不显著。同样，对于内侧注射，共定位百分比与空间坐标之间未观察到显著相关性。为了确定AAV和EdU共定位百分比是否受EdU+细胞密度或L2/3内层状位置的影响，我们将L2/3的整个深度划分为十个等间距的区间，并量化了每个区间中AAV+ EdU+神经元的比例，该比例针对局部EdU+细胞密度进行了归一化。该分析在所有四个实验组中进行。我们发现，在任何组中，沿L2/3深度的共定位百分比分布均无统计学显著差异。这些结果表明，动物组之间AAV+ EdU+共定位率的差异或相似性并非由注射位点位置、EdU标记密度或皮质深度等混杂因素驱动。

讨论

总之，结合出生日期标记和逆行标记，我们发现L2/3 V1→L-HVA神经元优先在E15.5生成，在E16.5生成减少，而L2/3 V1→M-HVA神经元在两个时间点以相似的速率生成。这些发现表明，L-HVA投射神经元存在时间偏向性的神经发生波，而M-HVA投射神经元的生成则更为均匀。

L2/3 CCPNs在基因表达、局部和长程连接以及功能角色上表现出相当大的多样性。我们的数据揭示了V1 CCPN亚型在出生率上的时间差异。然而，神经元出生日期本身似乎并不决定投射身份，因为在相同胚胎阶段生成的L2/3 CCPNs可以投射到不同的目标。此外，尽管V1→PM CCPNs的体细胞富集在第2/3层的上部，但它们与在E15.5或E16.5标记的EdU的共定位情况相当。尽管观察到E16.5出生的神经元比E15.5出生的神经元更靠近软脑膜表面，但情况仍然如此。这些发现表明，引导轴突靶向的机制可能与调节体细胞定位的机制不同，后者可能更直接地反映神经元出生日期。虽然L2/3 V1→M-HVA和V1→L-HVA CCPNs表现出不同的神经发生模式，但出生日期本身可能无法完全解释它们的亚型身份，包括层状分布的差异。支持这一解释的是，最近的研究结果表明，某些神经元亚型的皮质发生可能偏离通常与出生日期相关的经典由内向外模式，突显了皮质发育的额外复杂性。这就提出了一个问题：离散但时间上接近的神经发生波是如何产生如此异质的亚型的。在V1中，投射到高级视区（HVAs）的L2/3 CCPNs的多样性可能源于祖细胞起源的差异：例如，直接神经发生与间接神经发生（来自放射状胶质细胞或中间祖细胞）。或者，这种异质性可能反映了深度依赖的、连续的转录程序变化，这些程序在皮质发育过程中调控细胞类型特化，这与出生日期依赖的由内向外层状组织模式一致。更具体地说，参与轴突引导和连接的细胞识别分子，如Cdh12/13、Cntn2/5、Epha3/6、Sema4a/6a和Robo1，在沿层状深度分布的L2/3亚型中差异表达。这些分子通路是否有助于与投射身份相关的亚型特化仍然是一个悬而未决的问题。最近的研究还表明，视觉剥夺会改变V1 L2/3中的基因表达和细胞类型组成，这表明活动依赖性机制可能进一步影响投射特异性亚型的特化。这是未来研究的一个重要方向。

我们的研究有几个局限性。首先，基于EdU的出生日期标记提供的时间分辨率相对较粗，难以精确确定神经元出生日期的确切时间。小鼠使用12小时的交配窗口进行繁殖，将检测到阴道栓的时间指定为E0.5，这引入了动物间标记可能存在12小时变异性的问题。尽管在E14.5、E15.5和E16.5标记的EdU+细胞的空间分布在各窝次中大体一致，但一只动物（样本ID S01）显示出介于典型E14.5和E15.5模式之间的分布，这可能反映了这种变异性。此外，由于EdU在注射后仅1-3小时内具有生物利用度，我们不太可能捕获在L2/3神经元神经发生期间每个标记日出生的全部神经元群体。为了获得更精细的出生日期分辨率，FlashTag（一种可标记M期顶端祖细胞的可渗透细胞荧光染料）已被开发出来，并应用于以更高精度追踪神经元出生日期。这种方法实现了详细的命运图谱绘制，包括下游应用如下一代测序，并可能作为未来研究的有价值工具。尽管如此，我们通过分析来自独立繁殖者和窝次的多个动物，并应用严格标准来识别出生日期标记的神经元（选择在EdU施用当天退出细胞周期前的最后一个S期掺入标记的EdU+细胞），减轻了这一潜在局限性。其次，逆行标记方法仅揭示投射到注射靶点的神经元，并未捕获神经元轴突分支的完整范围。因此，本研究未绘制CCPNs的完整投射模式，连接出生日期与完整投射身份的全面分析仍有待进行。

基于目前的发现，未来使用互补方法的研究可能有助于阐明出生时间如何促进具有不同投射身份的L2/3神经元的发育。一个有前景的策略是使用转基因小鼠系进行遗传出生日期标记，这些品系允许永久标记在特定胚胎阶段出生的神经元。例如，可诱导的CreER品系（如Neurog1-CreER、Neurog2-CreER或Tbr2-CreER）与Cre依赖的Flp表达报告基因（例如，loxP-STOP-loxP-Flp）杂交，可在定义的胚胎时间点使用他莫昔芬进行诱导。在成年后代中，可以将Flp依赖的病毒追踪剂（如AAV-fDIO或FLEx^frt荧光蛋白）注射到V1中，以选择性标记在这些时间点出生的神经元的轴突。这种方法能够直接量化V1 CCPN轴突在内侧与侧向HVAs中的分布，从而可以比较早期和晚期出生的L2/3神经元。该策略能够测试L2/3 CCPNs的早期与晚期出生日期是否广泛地与高级视区中沿内侧-外侧轴的不同V1投射模式相关。并行地，对这些发育标记的神经元进行转录组或表观基因组分析，可能揭示亚型特化和投射身份背后的分子机制。未来研究的一个重要问题是，在其他皮质区域的CCPNs中是否观察到类似的神经发生时间模式。例如，次级视皮层中投射到其他HVAs的L2/3 CCPNs，或初级体感或听觉皮层中投射到次级皮质区域的L2/3 CCPNs。