搅拌式生物反应器中无血清/无异源培养基与细胞因子补充对CAR-T细胞疗法生产的优化作用及机制研究

本综述系统探讨了无血清/无异源培养基（SXFM）及不同细胞因子（IL-2 vs. IL-7/IL-15）在静态（G-Rex）与动态（搅拌式生物反应器，STR）培养体系中对CAR-T细胞扩增效率、转导效果、免疫表型（如CD4:CD8比率）及功能活性（如细胞毒性）的调控作用。研究证实SXFM结合STR平台可显著提升生产工艺的一致性、安全性与可扩展性，为符合GMP标准的CAR-T疗法规模化生产提供关键技术支持。

　　

引言

嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）疗法在血液恶性肿瘤治疗中展现出显著临床疗效，目前已获多个监管机构批准。然而，为实现临床及商业化需求，亟需建立稳健的生产平台并采用符合良好生产规范（GMP）标准的试剂。本研究重点探讨无血清/无异源培养基（SXFM）及细胞因子（IL-2或IL-7/IL-15组合）在静态（24孔板G-Rex）与动态（500 mL搅拌式生物反应器，STR）培养系统中对CAR-T细胞生产的影响。

材料与方法

T细胞分离与培养

外周血单核细胞（PBMC）通过泛T细胞分离试剂盒（Miltenyi Biotec）分离，并冷冻保存于CS10冻存液。复苏后细胞以1–2×10⁶ cells/mL密度接种，24小时后使用TransAct试剂（Miltenyi Biotec）激活，并分别添加IL-2（30 IU/mL）或IL-7/IL-15（10 ng/mL）。

培养基与转导

实验采用两种培养基：含10%胎牛血清（FBS）的RPMI基础培养基，以及无血清/无异源培养基（SXFM，CellGenix Advanced TCM）。慢病毒转导采用第三代载体系统，通过spinoculation法在retronectin包被的6孔板中进行，转导后细胞接种于T瓶进行预扩增，再转移至扩增平台。

扩增平台

静态培养使用G-Rex 24孔板，接种密度为0.5×10⁶ cells/cm2，培养体积8 mL/孔，第4天进行75%培养基更换。动态培养采用500 mL STR（Getinge MiniBio），通过marine桨叶搅拌（功率数Po=1.5），控制单位体积功率（P/V）为74×10^?4 W/kg，搅拌速度250 rpm。过程中严格调控pH（7.2±0.2）、溶氧（DO，50%）、温度及气体流量，采用分批补料策略（第3天补100 mL，第4天补50 mL，第5天换液40%）。

分析方法

细胞计数与活力通过NucleoCounter NC-3000检测；代谢物（葡萄糖、乳酸、氨）浓度使用CuBiAn Bioanalyzer分析；免疫表型通过流式细胞术（BD LSRFortessa）检测CD3、CD4、CD8、CCR7、CD45RO、CD69、PD-1、LAG-3等标志物；细胞毒性试验采用Incucyte S3系统，以CD19阳性NALM6细胞为靶点，效应靶比1:1共培养72小时。

结果

静态培养条件下的CAR-T扩增

在G-Rex平台中，不同培养基与细胞因子组合下细胞扩增倍数（39–49.6倍）、生长速率（0.460–0.488 d^?1）及最大细胞浓度（5.83–6.62×10⁶ cells/mL）无显著差异。代谢分析显示，RPMI组葡萄糖接近耗尽，而SXFM组仍维持>10 mmol/L；乳酸浓度范围为8–18 mmol/L，氨积累≤2 mmol/L。表型分析表明，SXFM组CD4:CD8比率更接近1:1，而RPMI组偏向1:2。CD8亚群以中央记忆细胞（~80%）为主，IL-7/IL-15组初始T细胞比例较高。激活（CD69）与衰竭（PD-1/LAG-3）标志物在扩增过程中均下降，表明其为瞬时表达。

动态培养条件下的CAR-T扩增

在STR中，SXFM组细胞扩增显著优于RPMI组，最大细胞浓度达5.56×10⁶ cells/mL（RPMI组为3.06×10⁶ cells/mL），生长速率最高为0.448 d^?1。转导效率在SXFM组更高（30–60%），且CAR表达稳定。CD4:CD8比率在SXFM组维持1:1，RPMI组为1:2。CD8亚群仍以初始/中央记忆表型为主（≥90%），衰竭标志物进一步降低。所有组别均表现出对NALM6细胞的显著杀伤活性，证实功能有效性。

讨论

本研究证实SXFM在静态与动态培养中均支持高效CAR-T扩增，且在STR中表现更优：提升转导效率、加速增殖、维持理想CD4:CD8比率。STR平台通过精确控制pH、DO等参数，显著增强工艺一致性，并支持封闭式操作，降低污染风险与洁净室等级要求。代谢数据表明SXFM可避免营养耗竭，乳酸积累低于抑制阈值（30 mmol/L）。表型结果与功能试验一致，SXFM未引起异常分化或衰竭，符合治疗性细胞产品特征。

结论

SXFM（尤其联合IL-2）可优化CAR-T细胞在STR中的扩增效率、转导效果及免疫表型，同时规避FBS相关的批次间变异、病原体风险与监管复杂度。该策略为GMP级CAR-T生产提供标准化、可放大的工艺基础，支持自体与异体疗法的临床转化。

作者贡献与利益冲突

Pedro Silva Couto与Dale Stibbs主导实验设计与执行；Qasim Rafiq监督项目并获取资金；多位作者参与数据解读与文稿修订。部分作者任职于Sartorius CellGenix、Fraunhofer研究所等机构，可能存在商业利益关联。