DNA Divers：基于志愿者环境DNA捕获技术的全球海洋生物多样性监测新策略

本文推荐了一项创新性研究，探讨了基于志愿者参与的环境DNA（eDNA）被动捕获技术对海洋生物多样性监测的规模化应用。通过潜水员携带填充医用纱布的3D打印装置（metaprobe）在游泳过程中吸附eDNA，并与传统水过滤方法对比，证明该方法可有效检测275种鱼类和软骨鱼类别（其中180种鉴定至物种水平），覆盖90°纬度范围内的多种生境。该技术为公民科学（citizen science）赋能大规模eDNA监测提供了可行路径，同时有助于提升公众科学素养。

　　

引言：海洋生物多样性监测的挑战与新机遇

海洋和沿海栖息地在调节水质、疾病和气候过程中发挥关键作用，同时提供渔业、旅游和娱乐等生态系统服务。生物多样性丧失导致这些栖息地健康衰退和生态系统服务减弱。环境DNA（environmental DNA, eDNA）分析作为一种新兴技术，能够准确监测从微生物到巨型动物的多种生物类群，但其应用面临规模化采集的瓶颈。传统水过滤方法即使借助真空泵或自主采样器仍耗时且成本高昂。

与常规方法相比，eDNA分析在海洋管理和保护中展现出独特优势：它不依赖专家分类学家或可见条件，能够检测肉眼不可见或显微镜难以区分的生物，同时避免对脆弱栖息地的物理干扰和标本采集。研究表明，eDNA分析在海洋环境中通常比视觉潜水调查获得更高的物种丰富度，甚至能在短距离（<100米）内区分不同生境的群落。尽管科学界持续证明eDNA分析相对于传统监测方法的优势，但将其纳入正式监测策略的努力尚未实现。

公民科学（citizen science）作为生物数据最大且增长最快的来源之一，通过非专业科学家的参与显著扩展了研究的覆盖范围和可行性。例如，通过网络平台（如Zooniverse、SciStarter、iNaturalist）招募志愿者收集和分析大量数据，这一概念已被用于扩大eDNA监测规模。丹麦曾组织志愿者在协调时间点采集整个海岸线的水样，提供沿海鱼类生物多样性的快照。

被动eDNA捕获技术作为过滤的替代方案近年来受到关注。早期研究测试了多孔材料（如蒙脱石粘土和颗粒活性炭）吸附细胞外DNA的能力，发现经过数天至数周的浸泡，这些材料积累的DNA量与过滤1升水相当。在自然环境中，悬浮在水柱中长达24小时的滤膜被动捕获的eDNA与主动过滤的海水相比，检测到172种鱼类 taxa，其中109种通过被动方式在悬浮膜上检测到。尽管这些被动eDNA捕获技术需要数小时至数天的部署时间，但装置可以无人看管，这意味着研究人员可以将时间用于其他任务，并且复制潜力无限，与过滤eDNA相比，后者需要更多时间投入来增加复制。

方法与方法学：DNA Divers项目的设计与实施

样本采集在英国、佛得角、约旦、挪威、南非和美国的不同自然潜水点进行，包括蓝星球水族馆（Blue Planet Aquarium）的展示池。在某些地点，收集了常规过滤的eDNA，与潜水员或浮潜者佩戴metaprobe收集的eDNA进行比较。过滤样本使用漂白清洁的1.5升塑料瓶收集，并通过0.45微米Sterivex过滤器（PES膜，Merck Millipore）现场过滤。Sterivex过滤器通过推动空气通过 cartridge 进行干燥。

Metaprobe使用聚乳酸（polylactic acid, PLA）3D打印，并在可能的情况下在实验室制备。Metaprobe填充一到三卷无菌医用棉纱布，通过实践确定两卷中等尺寸的棉纱布卷（10厘米×3.7米）足以进行子采样。Metaprobe纱布使用硅胶珠干燥或存储在100%分子级乙醇中。在蓝星球水族馆，收集了过滤器和metaprobe样本，同时进行了控制时间实验，将metaprobe浸泡在展示池中。时间实验在两个独立的池中重复进行（即“海洋展览”和“珊瑚洞”）。在每个池中，将五个metaprobe放入网状潜水袋中，允许在池表面浸泡；在每个时间点（10、30、60、120和240分钟）取出一个并保存。

DNA提取在专门的eDNA实验室中进行，该实验室经过净化协议，仅用于eDNA提取。使用Qiagen DNeasy Blood and Tissue kit或非商业发布的模块化协议“Mu-DNA”从metaprobe纱布和sterivex过滤器中提取DNA。sterivex过滤器从胶囊中取出，使用钳子打破塑料，将保持过滤器的中心柱倒到培养皿上。然后使用镊子从胶囊的中心柱上取下过滤器。一半过滤器保存为档案材料，另一半使用解剖剪刀切成小块，放入1.5毫升Eppendorf管中。

通过聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）扩增每个提取物的三个重复。使用tele02或elas02引物靶向12S rRNA基因的167和171 bp区域。纯化的PCR产物使用Qubit dsDNA HS Assay kit（Invitrogen）定量，并以等摩尔浓度 pooled。使用NEXTFLEX? Rapid DNA-Seq Kit for Illumina（PerkinElmer）将独特的 adapter 序列连接到每个文库。在利物浦约翰摩尔斯大学使用Illumina iSeq100和iSeq i1 Reagent v2（300 cycles）对文库进行测序。

序列文库在使用Local Run Manager中的样本运行表指定FASTQ生成后 demultiplexed， resulting 四个文库的正向和反向FASTQ文件。所有文库都按照相同的步骤处理，根据使用的引物进行修改。使用OBITools、VSEARCH和SWARM软件进行序列处理、去重复、嵌合体去除和聚类。使用全球和本地参考数据库通过OBITools::ecotag、VSEARCH::sintax和BLAST+进行 taxonomic 分配。

结果：从实验验证到全球应用

共测序190个样本，包括16个注射器过滤的水性eDNA样本、10个来自时间浸泡实验的metaprobe和43个潜水员metaprobe，其中大多数用于实验室协议测试的子采样。组合测序文库在生物信息学质量控制后产生6,172,921条 reads，其中90%（5,579,301 reads）被分配 taxonomy， identity score ≥98%并保留用于分析。

通过注射器过滤1.5升海水通过sterivex过滤器（过滤样本）捕获的eDNA与潜水员佩戴metaprobe收集的eDNA在四个潜水点进行比较：蓝星球水族馆的海洋展览、利物浦的Dukes Dock以及奥克尼的SMS Bayern和SMS Brummer潜水点。在自然环境中收集的过滤样本导致更高数量的独特类群检测（即65%至73%），而metaprobe eDNA检测的独特类群较少（即4%至10%）。这与在蓝星球水族馆收集的样本不同，后者有较大比例的类群（约65%）被两种方法检测到，而不是单一方法代表的多数。

在自然位置，过滤样本和metaprobe eDNA样本可以从已知物种 inventory 进行基准测试。使用针对软骨鱼检测设计的引物分析海洋展览中的样本，其中饲养了12种软骨鱼物种。由于四种物种缺乏12S参考序列以及无法自信地（≥98% identity score）分配斑纹虎鲨（Heterodontus zebra），只有七种软骨鱼物种可以鉴定到物种水平。尽管某些物种缺乏参考序列，但使用属于同一属的其他物种的序列来分配属水平 taxonomy，最终总体检测到10种软骨鱼类群（即七种物种水平，三种属水平）。

与蓝星球水族馆海洋展览中的潜水无关，额外的metaprobe被浸泡以隔离和理解暴露于水的时间与eDNA捕获之间的关系。Metaprobe在漂白清洗的潜水袋中悬浮不同长度的时间，最长可达240分钟。从浸泡实验中，在10分钟内检测到五种软骨鱼物种，但到60分钟时，检测到所有10种可识别的软骨鱼（即结合10、30和60分钟的所有六个样本）。不结合时间点，浸泡240分钟的样本是唯一单独包含所有10种软骨鱼类群的样本。

浸泡实验在一个较小的展览中复制，称为“珊瑚洞”，其中包含热带鱼物种。作为代谢编码目标的 teleosts，检测数量也随时间增加，浸泡60分钟时检测到 read 丰度最高的前10个类群。结合珊瑚洞和海洋展览的数据，发现浸泡时间是决定每个样本检测到的MOTUs数量和独特类群数量的 statistically significant 因素。当添加潜水员收集的样本（从50和65分钟潜水中收集）时，时间与检测之间的关系减弱，但仍然显著。

为了评估哪种现场和实验室技术效果最好，首先测试了输入纱布材料和裂解缓冲液的量是否影响DNA提取结果在物种丰富度方面，考虑到DNA随机粘附棉花的程度不确定性。发现棉花的输入量或裂解缓冲液没有显著差异。比较不同的DNA提取方法时，发现技术之间（即Mu-DNA或Qiagen DNeasy Blood and Tissue kit）没有显著差异。最后，测试了不同的保存技术是否影响物种丰富度，发现保存有强烈影响，乙醇保存的子样本比相应的硅胶保存的棉花更可能具有更高的物种丰富度。

在英国，志愿者努力提供了北大西洋近海鱼类生物多样性的快照， resulting 84个独特属或物种水平类群检测到。在潜水地点检测到的脊椎动物群落根据ICES分区显著分离，这些分区部分根据生物地理学建立，但也用于渔业管理目的。在北大西洋广泛分布常见的物种，如大西洋鳕鱼（Gadus morhua）、银鳕（Gadiculus argenteus）、 butterfish（Pholis gunnellus）和北方 rockling（Ciliata septentrionalis），没有聚集在单一组样本附近，而是占据中性空间，表明它们在多个位置的重要性。

总共从六个国家收集样本：佛得角、英格兰和苏格兰（英国）、约旦、挪威、南非和美国。当将样本和物种绘制在CCA ordination 上时，国家之间沿纬度梯度显著不同，并且 between ocean basins。大多数物种点聚集在每个国家的相应样本周围，有一个明显的例外：在北大西洋和北太平洋盆地都检测到的 cosmopolitan 远洋翻车鱼（Mola mola）。在180个物种水平检测中，18个（10%）根据IUCN红色名录标准被 classified 为“近危”或更严重。两个极度濒危的鱼类，欧洲鳗鲡（Anguilla anguilla）和巨吉他鱼（Rhynchobatus djiddensis），分别在英格兰和南非检测到。一种濒危射线， reticulate whipray（Himantura uarnak），在南非检测到。总共有六种软骨鱼被 classified 为易危，其中包括，例如，在美国检测到的长尾鲨（Alopias vulpinus）和在挪威检测到的 spurdog 或 spiny dogfish（Squalus acanthias）。在所有国家中，来自南非的样本包含最多的受威胁物种检测，尽管在该国仅进行了两次潜水，每次仅部署两个metaprobe，并且所有样本都保存在硅胶珠中以便于运输。

讨论：协议优化、方法比较与全球潜力

基于测序结果的差异和最方便的采样目的，迭代改进了采样协议。保存方法（即硅胶珠或100%乙醇）影响物种丰富度检测，使得乙醇保存的 replicates 表现显著更好。这些metaprobe样本暴露于相同的现场和实验室条件，但通过分割棉纱布并不同保存以比较方法。尽管通过硅胶脱水保存与乙醇相比产生不满意的DNA回收，但在南非收集的样本专门保存在硅胶珠中以简化运输物流。从南非收集的四个metaprobe中，12个子样本中的11个包含目标类群。值得注意的是，在南非使用的采样容器很大（200毫升），每个纱布块放在单独的容器中（即每个metaprobe 3个独立容器（总共12个）用于棉花材料），允许硅胶珠与样本的体积比约为3:1。似乎如果棉纱布完全脱水，硅胶珠可以工作，但在材料限制下实际实现干燥条件很困难。这与先前的研究不同，其中metaprobe被放置在底拖网中，并且乙醇和硅胶珠保存方法的效率没有显著差异。商业提取协议（Qiagen Blood and Tissue kit）与非商业方法（Mu-DNA Tissue protocol）没有显著差异，不同输入棉纱布和裂解缓冲液的量也是如此。发现乙醇保存并使用Qiagen Blood and Tissue DNA提取试剂盒（即每个DNA提取提供1000 μL提供的裂解缓冲液，Buffer ATL）与0.2至0.4克棉纱布产生最一致和可靠的结果。

潜水员metaprobe区分了来自不同采样地点的脊椎动物群落，并检测到与相应的水性eDNA样本相似的群落。在水族馆环境中，潜水员metaprobe与典型的过滤水性eDNA样本相比，导致 statistically similar 群落组成，其中约65%检测到的鱼类相同。当比较软骨鱼的检测时，每种方法的至少一个样本包含所有10个独特软骨鱼检测。然而，潜水员metaprobe比过滤的eDNA包含更多独特检测（即约20%对约15%）。这些观察与在自然中收集的潜水员和过滤样本明显不同，其中每种方法检测的重叠在20%至30%之间，过滤的eDNA样本包含65%至75%的独特类群。这种重叠百分比低于先前使用主动过滤和被动eDNA捕获在不同类型悬浮过滤器上的研究，其中主动和被动方法共享43%至75%的物种检测；然而，这是在每个地点部署约70个被动捕获 replicates，浸泡时间在4至24小时之间，这对于水肺潜水来说不是一个可行的场景。

过滤水捕获eDNA所需的数量因目标分类群和采样的栖息地而异，类似地，我们预计影响暴露于环境的因素，如水中的时间、潜水员覆盖的距离和场地水动力学以及栖息地类型，都可能深刻改变最佳样本量。显然，我们在水族馆的实验表明，检测随时间的增加 statistically，但当加入潜水员收集的样本时，这种关系的强度减弱，这表明潜水员的游泳运动可以增加纱布中的eDNA积累率，与静止浸泡的metaprobe相比。先前的被动eDNA捕获现场实验表明，物种丰富度不随时间增加，并且浸泡时间之间的关系仍不清楚，但有可能在较长的采样期内，eDNA有时间从捕获基质上解吸（在初始吸附之后）。为潜水员metaprobe在未来 targeted 栖息地类型中建立这些阈值可以 enable 进一步理解如何实施这种监测策略。

在四个我们收集了过滤eDNA样本和潜水员metaprobe的地点，群落结构在采样策略之间没有显著差异。此外，当比较在温带北大西洋栖息地（即英国和挪威沿海）检测到的脊椎动物群落时，采样地点的群落可以根据其相应的ICES咨询区域进行 segregation，证明这种方法可用于大规模监测。

三十九个metaprobe样本由志愿者在六个国家收集， resulting 275个脊椎动物类群分配到属或物种，其中180个鉴定到物种水平。在某些情况下，这种生物多样性记录是通过 modest 数量的metaprobe获得的：在南非收集的样本来自两次潜水（即由一对潜水伙伴），仅来自四个单独metaprobe的棉花材料，而佛得角、加利福尼亚和约旦的采样事件每次仅包括一次潜水，只有一对潜水伙伴中的一名潜水员佩戴metaprobe。这些metaprobe的棉花子采样三份进行测序，代表不到测序样本的15%（n=21），但回收了132个海洋类群（14个属水平，118个鉴定为物种）。尽管在北大西洋以外的采样努力相对较低，但在潜水地点检测到的脊椎动物群落国家之间显著不同，并按 ocean basins 和跨纬度分组。有某些脊椎动物是潜水地点独有的，并占 read 计数的大部分，例如：在加利福尼亚反映附近殖民地的加利福尼亚海狮（Zalophus californianus）17,933 reads，在南非9英里礁的 round ribbontail ray（Taeniurops meyeni）14,158 reads，和在英国利物浦Dukes dock的三刺鱼（Gasterosteus aculeatus）47,524 reads。 Round ribbontail rays 是我们检测到的12个被IUCN classified 为易危的物种的一个例子。通过相对低努力采样，我们检测到重要的渔业物种，这些物种被IUCN classified 为数据缺乏，包括 lesser sand eels（Ammodytes tobianus）和 common sole（Solea solea）。一些检测是稀有软骨鱼，如加利福尼亚的长尾鲨（Alopias vulpinus）和南非的巨吉他鱼（Rhynchobatus djiddensis），突出了这些由志愿者收集的数据如何有意义地贡献于全球生物多样性数据存储库。

这个项目向公众传达为“DNA Divers”，展示了如何让海洋休闲爱好者参与eDNA研究，并在此过程中了解新兴技术和更广泛地监测生物多样性的重要性。已经有成功的公民科学项目与志愿者合作收集eDNA或进行水肺潜水进行视觉调查。Metaprobe可以3D打印，医用棉纱布广泛可用，这些材料可以轻松组装并使用 cable ties 连接到潜水员的BCD（浮力控制装置）或配重带上。相对于需要分类学训练的视觉普查，这具有几乎不需要培训水肺潜水员或浮潜者参与收集 marine eDNA的优势。此外，在英国，休闲潜水员进行的视觉普查无法执行行业标准调查方法，如 transects，因为这违反了《1997年工作潜水条例》。这意味着志愿者收集的任何eDNA代谢编码数据都与视觉普查信息 concomitant，并且可以提供与潜水地点更普遍相关的两层物种存在数据，而不违反工作潜水法律。在利物浦的Dukes Dock，志愿者Seasearch潜水员在收集eDNA的同时完成了视觉普查 survey，最终筛选 teleost 物种。潜水员看到了三种鱼类和几种无脊椎动物类群。两种方法都包含了对三刺鱼（Gasterosteus aculeatus）和黑虾虎鱼（Gobius niger）的观察。潜水员记录了许多无脊椎动物，包括贻贝（Mytilus edulis）、欧洲绿蟹（Carcinus maenas）和黄色太阳海绵（Halichondria bowerbanki），而metaprobe eDNA targeting 一个脊椎动物基因，因此也捕获了城市景观水平的物种，如海鸥（Larus sp.）和家鼠（Mus musculus）。第二 read 丰度最高的鱼类是极度濒危的欧洲鳗鲡（Anguilla anguilla），潜水员未看到，但潜水员看到了两点虾虎鱼（Gobiusculus flavescens），在eDNA中未检测到。视觉观察将始终是海洋生物多样性数据的宝贵来源，但被动eDNA收集可能是众包分子样本、补充监测努力并包括更广泛 demographic 的水肺潜水员和海洋休闲用户（即 kayakers, paddle boarders）的一种方式，他们要么没有时间、兴趣，要么没有资源参与分类学培训。

对使用eDNA代谢编码进行非侵入性生物多样性 surveillance 的被动方法有广泛兴趣。什么构成“被动 surveillance”的语义可能不同。一些方法被标记为被动，因为使用海洋机器人进行水过滤的自动化过程，而其他被动技术探索了DNA与浸没材料的结合。在我们的案例中，我们依赖后者以及志愿者水肺潜水员和浮潜者的 exertions 和探索活动。这项研究受益于约30名潜水员的参与，他们在四个大洲的多种栖息地（即海草床、海藻林、沉船、峡湾、珊瑚礁）进行潜水， resulting 总体检测到275个不同类群。尽管潜水员metaprobe可能捕获的物种少于通常使用传统eDNA水过滤从给定区域检测到的物种，但它们仍然有效地区分区域和全球尺度的组合，并以相对低的努力检测具有保护重要性的物种。虽然我们并不建议我们的方法排除了工程自主eDNA采样仪器的需要，但“DNA Divers”方法的巨大潜力是不可否认的：许多沿海海洋区域仍然监测不足，而志愿者似乎非常渴望接受这种方法。通过这种自制的普遍 accessible 方法，可以合理预期快速积累来自世界几乎所有地区的eDNA样本，从而升级和推动海洋监测，同时提高公众意识和改善科学素养。