ABA与钙信号协同调控柑橘糖积累的分子机制：SRK2A/CIPK6-ABI5-TST2模块的枢纽作用

本文揭示了脱落酸（ABA）与钙信号通过磷酸化转录因子CsABI5协同调控柑橘果实糖积累的核心机制。研究发现CsSRK2A（ABA信号通路关键激酶）和CsCIPK6（钙信号相关激酶）分别磷酸化CsABI5的不同位点，增强其对液泡糖转运蛋白基因CsTST2的转录激活能力。尤为重要的是，CsABI5直接结合CsCIPK6启动子形成正反馈循环，首次在非呼吸跃变型果实中阐明了ABA与钙信号交叉对话调控品质形成的新范式。

　　

1 引言

糖分含量是决定肉质果实风味品质的关键因素，液泡作为糖分储存的主要场所，其糖分积累过程由液泡膜糖转运蛋白（TSTs）介导。在柑橘等非呼吸跃变型果实中，脱落酸（ABA）和钙离子（Ca²⁺）分别作为重要植物激素和第二信使，在果实发育和品质形成中发挥核心作用。前期研究表明，柑橘果实发育过程中ABA和钙水平伴随糖积累同步增加，但二者协同调控糖积累的分子机制尚未明确。本研究旨在揭示ABA与钙信号交叉对话调控柑橘果实糖积累的分子网络，重点关注液泡糖转运蛋白基因CsTST2的转录调控机制。

2 结果

2.1 ABA和钙通过上调CsTST2表达促进柑橘果实糖积累

外源施加ABA或钙处理显著提高了甜橙果实内源ABA和钙含量，导致果糖、葡萄糖和蔗糖含量显著上升，同时伴随液泡糖转运蛋白基因CsTST2转录水平的显著上调。这表明ABA和钙通过调控CsTST2表达介导柑橘果实的糖分积累过程。

2.2 CsABI5通过直接结合启动子增强CsTST2表达

通过共表达聚类分析筛选出5个与CsTST2共表达的转录因子，其中CsABI5（ABA信号通路关键转录因子）对CsTST2启动子的转录激活能力最强。亚细胞定位显示CsABI5定位于细胞核，其蛋白与mRNA表达水平与CsTST2呈显著正相关。酵母单杂交（Y1H）、电泳迁移率变动分析（EMSA）和染色质免疫沉淀（ChIP-PCR）实验证实CsABI5特异性结合CsTST2启动子中的ABA响应元件（ABRE）。

2.3 CsABI5通过上调CsTST2表达促进糖积累

在柑橘汁囊和愈伤组织中过表达CsABI5显著提高CsTST2转录水平和糖分含量，而干扰CsABI5表达则导致相反表型。在CsTST2沉默背景下过表达CsABI5不能有效提升糖含量，证明CsABI5对糖积累的促进作用依赖于CsTST2的表达。

2.4 CsCIPK6和CsSRK2A与CsABI5相互作用

酵母双杂交（Y2H）筛选发现钙信号相关激酶CsCIPK6和ABA信号通路激酶CsSRK2A与CsABI5相互作用。进一步通过GST pull-down、双分子荧光互补（BiFC）、荧光素酶互补成像（LCI）和共免疫沉淀（Co-IP）实验验证了这两种激酶与CsABI5在体内外的物理互作。CsCIPK6与钙感应蛋白CsCBL1形成复合物，两者均定位于细胞质和细胞核。

2.5 CsSRK2A和CsCIPK6磷酸化CsABI5增强其转录活性

体外磷酸化实验表明CsSRK2A和CsCIPK6均能磷酸化CsABI5。质谱分析鉴定出CsSRK2A磷酸化CsABI5的Ser40、Ser109、Thr112和Ser134位点，而CsCIPK6磷酸化Ser39和Ser40位点。双荧光素酶报告基因检测显示这两种激酶通过磷酸化CsABI5显著增强其对CsTST2启动子的转录激活能力，而磷酸化位点突变体（CsABI5^2m和CsABI5^4m）则削弱了这一促进作用。

2.6 CsCIPK6和CsSRK2A促进糖积累依赖于CsABI5磷酸化

在柑橘愈伤组织中过表达CsSRK2A或CsCIPK6提高CsABI5磷酸化水平、CsTST2表达和糖含量，干扰表达则呈现相反表型。在CsABI5沉默背景下过表达CsSRK2A或CsCIPK6不能有效提升CsTST2表达和糖积累，证明这两种激酶的功能依赖于CsABI5。

2.7 CsABI5结合CsCIPK6启动子并促进其转录

表达分析显示CsCIPK6转录水平随果实发育逐渐升高且受ABA诱导，与CsABI5表达呈正相关。启动子分析发现CsCIPK6启动子含有两个ABRE顺式作用元件。通过Y1H、LUC、EMSA和ChIP-PCR实验证实CsABI5直接结合CsCIPK6启动子中的ABRE元件并激活其转录，形成正反馈调控环路。

3 讨论

本研究系统阐明了ABA和钙信号协同调控柑橘果实糖积累的分子机制。CsABI5作为核心整合节点，接受CsSRK2A（ABA信号）和CsCBL1/CsCIPK6（钙信号）的磷酸化修饰，增强对液泡糖转运蛋白基因CsTST2的转录激活。创新性地发现CsABI5直接调控CsCIPK6表达，形成正反馈循环使钙信号能够长期响应ABA信号，从而持续促进糖分积累。这一CsSRK2A/CsCIPK6-CsABI5-CsTST2模块的发现，首次在非呼吸跃变型果实中揭示了ABA与钙信号交叉对话调控品质形成的新机制，为果实品质改良提供了重要理论依据和靶点基因。

4 材料与方法

实验材料包括甜橙（Citrus sinensis）和柚（Citrus grandis）果实及愈伤组织。通过外源激素处理、基因过表达/干扰、亚细胞定位、蛋白互作和磷酸化分析等技术手段，结合分子生物学和生化实验方法验证调控机制。采用GC-MS测定糖含量，HPLC-MS/MS测定ABA含量，ICP-OES测定钙含量。所有实验均设三次生物学重复，数据进行统计学分析。