靶向中枢神经系统递送橙皮苷纳米粒作为瘦素增敏剂治疗肥胖相关睡眠呼吸障碍的新策略

本研究发现自组装橙皮苷纳米粒（HE NPs）可高效跨越血脑屏障，通过减轻下丘脑内质网应激（ER stress）和增强STAT3磷酸化，显著改善饮食诱导肥胖（DIO）小鼠的瘦素抵抗及睡眠呼吸障碍（SDB）。该研究为肥胖相关阻塞性睡眠呼吸暂停（OSA）提供了具有靶向性和协同治疗潜力的新型纳米治疗策略。

　　

1 引言

阻塞性睡眠呼吸暂停（OSA）是一种常见的睡眠呼吸障碍，其发病率随着肥胖流行和人口老龄化而持续上升。肥胖作为OSA的主要危险因素，通过多种机制促进疾病发展：脂肪沉积改变上气道结构，增加塌陷风险；腹部脂肪减少肺容积，削弱咽部纵向牵引力；而瘦素抵抗则损害通气调节，加剧呼吸暂停事件。当前治疗策略面临显著挑战：生活方式干预难以维持长期体重减轻（成功率<10%），而一线治疗持续气道正压通气的依从率仅为30%–60%。这些局限性凸显了对新治疗策略的迫切需求。

瘦素是由脂肪组织分泌的关键激素，它穿过血脑屏障作用于下丘脑和延髓，通过长型瘦素受体和下游STAT3信号通路发挥抑制食欲和增强能量消耗的作用。研究还表明，瘦素在呼吸调节中扮演关键角色：瘦素缺陷型ob/ob小鼠表现出对高碳酸血症通气反应敏感性降低，而补充瘦素可改善睡眠期间的上气道反射并减少吸气流量限制。然而，肥胖人群中普遍存在的瘦素抵抗严重限制了瘦素的治疗潜力，其机制与下丘脑神经元中的内质网（ER）应激密切相关：持续的ER应激破坏未折叠蛋白反应，干扰瘦素信号传导，降低下丘脑瘦素敏感性。这些发现不仅确立了瘦素作为肥胖相关OSA的潜在治疗靶点，还表明靶向ER应激以改善瘦素抵抗可能代表一种新的治疗策略。

橙皮苷（HE）是一种在柑橘类水果中大量存在的黄烷酮糖苷，具有多种药理活性。研究表明，HE不仅具有抗氧化、抗炎和免疫调节特性，还能通过调节MAPK、NF-κB和TNF-α等多种信号通路有效缓解ER应激和炎症反应。尽管HE具有强大的ER应激调节能力，但其在OSA治疗中的应用尚未探索。此外，HE面临显著的临床挑战：水溶性差（25°C时为5.92 ± 0.49 μg mL^?1）、分配系数低、细胞膜通透性差，最终导致生物利用度不理想。为解决这些问题，纳米技术提供了有前景的解决方案。

基于此背景，本研究创新性地开发了橙皮苷纳米粒（HE NPs）递送系统。通过利用小分子自组装技术，HE NPs不仅克服了HE低生物利用度的局限性，还充分发挥了其ER应激调节作用。我们系统评估了HE NPs对瘦素抵抗的调节作用，并深入研究了其在改善睡眠呼吸障碍（SDB）小鼠模型代谢和呼吸功能中的作用，为OSA治疗提供了新的治疗策略。

2 结果

2.1 HE NPs的合成与表征

HE的化学结构显示其具有多个羟基和羰基官能团。为增强其水溶性和血脑屏障（BBB）通透性，采用溶剂乳化-蒸发法制备HE NPs。扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）分析显示，HE NPs呈棒状形态，直径约80 nm，长度约800 nm。zeta电位为-8.86 ± 3.77 mV。动态光散射（DLS）测量显示流体动力学直径为366.5 ± 162.90 nm，多分散指数（PdI）为0.193。在PBS中监测6天内，流体动力学直径和PdI保持稳定，证实了HE NPs至少6天的胶体稳定性。X射线衍射（XRD）分析表明，HE单体在12.24°、13.72°、15.58°、19.62°、22.56°、21.44°和24.84°（2θ）处显示尖锐的特征衍射峰，表明高结晶度；而HE NPs的衍射图案更平滑，表明结晶度降低。傅里叶变换红外（FTIR）分析显示，游离HE在3477 cm^?1处显示出强而宽的─OH伸缩振动峰，在1650 cm^?1处有对应于C═O伸缩的尖峰。与HE单体相比，HE NPs的特征吸收峰位置没有显著变化，这可能是由于其自组装是由分子间范德华力和多个官能团之间的协同相互作用驱动的。

2.2 HE NPs的生物分布和药代动力学

为了研究HE NPs的体内生物分布，通过静脉注射给健康裸鼠施用游离IR780、PLGA-IR780 NPs或HE-IR780 NPs。结果显示，在注射后24小时内，HE-IR780 NPs比游离IR780表现出更高的荧光强度，并且在给药后前8小时内超过PLGA-IR780 NPs。在DIO小鼠中，通过尾静脉注射游离C6、HE-C6 NPs或PLGA-C6 NPs。注射8小时后，收集脑组织和主要器官进行离体成像。结果表明，与PLGA-C6 NPs和游离C6相比，HE-C6 NPs在小鼠大脑中的信号显著增强，表明其能够有效穿过BBB并在脑组织中积累。为了进一步研究药代动力学，通过尾静脉向小鼠注射HE-C6 NPs。在不同时间点采集血液样本，通过测量C6荧光确定HE-C6 NPs的血药浓度。结果显示，注射HE-C6 NPs后4小时内，血液中的荧光强度迅速下降约50%。在随后的时间段内，与游离C6相比，HE-C6 NPs表现出更长的全身循环保留时间，表明在血液中具有优异的稳定性。

2.3 HE NPs减轻DIO小鼠的体重

DIO小鼠用对照溶剂、HE、PLGA NPs或HE NPs治疗14天。在所有组中，HE NPs表现出最显著的体重减轻（>20%, P < 0.001），显著优于其他治疗。HE NPs组的食物摄入量显著低于对照组（P < 0.01）和HE组（P < 0.05），但与PLGA NPs相比无显著差异（P > 0.05）。此外，HE NPs显著降低血浆瘦素水平（34.6 ± 2.0 ng mL^?1 vs 19.7 ± 3.2 ng mL^?1, P < 0.001）。食物效率比（FER）分析显示，HE NPs组的FER显著低于对照组，而瘦素与食物比（LFR）分析显示，HE NPs治疗的小鼠LFR更负，表明体重和瘦素的减少不仅仅是由于食物摄入减少。

在代谢评估中，所有治疗组相对于对照组的葡萄糖耐量（GTT）和胰岛素敏感性（ITT）均有所改善，其中HE NPs和PLGA NPs显示出最强的增强作用。脂质分析显示，HE NPs显著降低总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）（P < 0.05），但对甘油三酯（TG）没有影响。Western blot（WB）分析表明，HE NPs和PLGA NPs抑制下丘脑PERK磷酸化（表明ER应激减弱），同时提高STAT3磷酸化，表明瘦素受体通路激活。

为了评估潜在毒性，分析了肝脏（ALT、AST）和肾脏（UR、CR）功能的血清生物标志物。在任何治疗组中均未观察到不良反应；相反，HE NPs降低了这些参数，证实体重减轻是药理活性的结果而非毒性。组织学检查（H&E染色）表明，HE NPs改善了高脂饮食诱导的肝脂肪变性，而未引起心脏、脾脏或肾脏的结构损伤。总的来说，HE NPs在减轻体重、调节瘦素和激活通路方面优于HE和PLGA NPs，显示出卓越的治疗效果。因此，后续研究仅关注对照组和HE NPs。

2.4 HE NPs对瘦小鼠无影响

为了研究HE NPs治疗效果的普适性，对瘦小鼠进行了相同的治疗方案。结果显示，对照溶剂和HE NPs治疗均未显著改变瘦小鼠的体重，仅出现轻微波动，组间无统计学差异。累积食物摄入量和血浆瘦素水平也相当。GTT显示HE NPs治疗的瘦小鼠和对照组之间的葡萄糖清除率无显著差异，ITT显示两组之间的胰岛素敏感性相似。此外，脂质代谢相关标志物的分析表明，HE NPs治疗在瘦小鼠中与对照组相比未产生统计学上显著的TC、TG、HDL-C或LDL-C差异。这些结果表明，HE NPs对瘦小鼠的代谢参数没有显著影响。

2.5 HE NPs对ob/ob小鼠的影响

鉴于HE NPs的减重和抑制食欲作用仅在DIO小鼠中观察到，我们进一步研究了其在瘦素缺陷的ob/ob小鼠中的治疗效果以阐明潜在机制。首先，我们发现ob/ob小鼠下丘脑PERK磷酸化水平显著高于瘦小鼠，表明下丘脑ER应激升高。体重监测显示，HE NPs治疗并未显著降低ob/ob小鼠的绝对体重（P > 0.05），而与对照组相比，HE NPs组的体重变化百分比显著较低（P < 0.01），表明体重增加略有减弱。累积食物摄入量组间无显著差异（P > 0.05）。Western blot结果显示，HE NPs降低了ob/ob小鼠的下丘脑PERK磷酸化，但对STAT3磷酸化无显著影响。

为了探索HE NPs治疗效果与瘦素的关系，将ob/ob小鼠分为对照溶剂或HE NPs预处理组，每个亚组进一步用盐水或瘦素治疗。与对照溶剂+盐水组相比，瘦素治疗显著降低了ob/ob小鼠的体重和食物摄入量，而HE NPs与瘦素联合（HE NPs + 瘦素）进一步增强了这些效果。在对照溶剂预处理组中，瘦素治疗增加了下丘脑STAT3磷酸化而不影响PERK磷酸化，而HE NPs和瘦素的组合不仅进一步增加了STAT3磷酸化，还显著降低了PERK磷酸化水平。这些结果表明HE NPs具有瘦素增敏特性。

2.6 HE NPs在DIO小鼠中作为瘦素增敏剂

为了研究HE NPs的瘦素调节作用，我们测试了HE NPs和瘦素联合治疗在DIO小鼠中的影响。DIO小鼠用对照溶剂或HE NPs预处理，每个亚组然后用盐水或瘦素治疗。结果显示，与对照溶剂+盐水组相比，单独瘦素治疗对DIO小鼠的体重或食物摄入量无显著影响（P > 0.05），证实了DIO小鼠的瘦素抵抗。然而，HE NPs + 盐水治疗显著降低了DIO小鼠的体重和食物摄入量，并且HE NPs预处理显著增强了瘦素敏感性，表现为HE NPs + 瘦素组的体重和食物摄入量进一步减少。Western blot分析显示，在DIO小鼠中，对照溶剂+盐水和对照溶剂+瘦素治疗对STAT3磷酸化无显著影响，而HE NPs + 盐水显著提高了基础STAT3磷酸化水平。HE NPs + 瘦素治疗进一步增强了STAT3磷酸化，显著超过所有其他组，表明HE NPs增强瘦素信号传导并改善瘦素抵抗。

2.7 HE NPs改善DIO小鼠的睡眠呼吸障碍

先前的研究已证明DIO小鼠作为SDB模型的可行性。为了进一步评估HE NPs对睡眠期间呼吸功能的影响，我们分析了DIO小鼠在非快速眼动睡眠（NREM）和快速眼动睡眠（REM）期间的呼吸参数。在NREM睡眠期间，HE NPs治疗显著改善了DIO小鼠的吸气流量限制。虽然呼吸频率没有显著差异，但潮气量（Vt）、每分钟通气量（Mv）和峰值吸气流速（PIF）显著增加。此外，呼吸暂停指数（AI）从对照组的17.1 ± 3.5 events h^?1显著降至HE NPs治疗组的9.3 ± 3.0 events h^?1（P < 0.01）。在REM睡眠期间，HE NPs也显示出呼吸功能的显著改善，潮气量、每分钟通气量和PIF增加，AI从对照组的22.4 ± 5.6 events h^?1降至12.8 ± 3.9 events h^?1（P < 0.05）。这些发现表明HE NPs有效改善DIO小鼠在NREM和REM睡眠期间的呼吸功能。

3 讨论

本研究阐明了基于橙皮苷的自组装纳米粒（HE NPs）在治疗肥胖相关SDB中的多方面机制和潜在治疗应用。研究结果表明，HE NPs通过减轻下丘脑ER应激和增强STAT3磷酸化，显著改善DIO小鼠的瘦素抵抗。这一发现为瘦素抵抗的分子机制提供了新的见解，并为开发靶向ER应激的治疗策略奠定了理论基础。

橙皮苷是一种天然酚类化合物，因其强大的抗氧化和抗炎特性而受到关注。然而，其水溶性差和生物利用度低严重限制了其临床应用。为克服这些限制，本研究创新性地开发了自组装HE NPs。实验结果显示，与PLGA-C6 NPs和游离C6相比，HE-C6 NPs表现出更优的BBB穿透能力，有效将药物递送至脑组织。值得注意的是，本研究采用的自组装制备方法避免了外源性化合物的引入，确保了递送系统的生物相容性。药代动力学研究进一步证明，静脉注射HE-C6 NPs导致双相消除曲线：4小时内血液荧光迅速下降表明有效分布至靶组织，而随后的缓慢消除速率证实了延长的全身循环。这种独特的药代动力学行为可能归因于HE NPs的独特形态。研究表明，纳米粒的几何形状，特别是纵横比，显著影响其与生物系统的相互作用。HE NPs的棒状结构可能通过限制与细胞表面的接触来减少巨噬细胞吞噬，同时增强其穿越生物屏障的能力，从而优化药物递送。

在药理作用方面，HE NPs显著降低了DIO小鼠的食物摄入量和体重，同时调节了P-PERK和P-STAT3等关键信号分子的表达。HE NPs的治疗效果表现出瘦素依赖性：在瘦素水平低的瘦小鼠中未观察到显著效果，而在瘦素缺陷的ob/ob小鼠中，HE NPs对绝对体重影响有限但显著降低了